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研究简报 重组人成骨蛋白-1的离子交换及分子 排阻色谱法纯化及其复性研究* 中国生物工程杂志China Biotechnology, 2005, 25(12):70～74 赵甜娜王世立韩金祥** （山东省医药生物技术研究中心国家卫生部生物技术药物重点实验室济南250062） 摘要经发酵大量表达重组人成骨蛋白-1（rhOP-1）。SDS发现rhOP-1表达量占细菌总蛋白的35%。菌体经裂解、洗涤后，用8 mol/L 尿素溶解包涵体，离心后提取目的蛋白。经离子交换色谱法对变性状态下的目的蛋白进行纯化，绝大部分杂蛋白被去除，目的蛋白纯度达93%以上。为进一步提高目的蛋白浓度，采用分子排阻色谱法对目的蛋白进行再次纯化，纯度达98%以上。利用降低尿素梯度的方法对纯化的蛋白进行复性，二聚体的含量在50%以上。Western blot证明了复性后的目的蛋白以单体和有活性的二聚体的形式存在。 关键词重组人成骨蛋白1包涵体离子交换色谱分子排阻色谱 复性 收稿日期：20050525修回日期：20050728 *国家“863”计划资助项目(2003AA2Z3532） ** 通讯作者，电子信箱：zhaotianna@重组人成骨蛋白1（rhOP1）作为骨形成蛋白的一员，主要在骨、肾组织中表达，特别在骨发育和骨折愈合过程中高表达［1］具有强大的骨诱导活性，能够在体内、体外诱导骨、软骨形成，在自体骨表面可以生成关节软骨面，修复软骨、肌腱和韧带［2］。除了在骨科中的应用外，OP1能够抑制肾小球和肾间质纤维化［3］，通过自身调节来修复肾脏纤维化中肾小管的功能。2004年，美国FDA批准了OP1 PUTTY这一用于临床脊柱融合手术中的基因工程产品，其有助于类似自体骨的新骨生长，在椎管狭窄、退行性椎骨前移的病人行椎管减压术中加速脊柱融合过程［4］。 本文报道了rhOP1的发酵表达，同时探讨了离子交换色谱与分子排阻色谱在rhOP1纯化中的应用及其复性研究，为rhOP1的应用打下了基础。 1材料和方法1.1菌株与培养基 温控型 rhOP1/pBV221/E.coli DH5α，由本室构建并保存。LB液体培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，pH7.0。 1.2仪器与试剂 BioFlo5000发酵罐（NBS公司产品）；BIOLOGIC DUOFLOW柱层析系统（BioRad公司产品）；JY92II型超声波细胞粉碎仪（宁波新芝科技股份有限公司）；Power PAC3000型电泳仪（BioRad公司产品）；AllegraTM64R高速冷冻离心机（BECKMANCOULTER公司产品）；电子天平Sartorius公司产品；Ph211 Microprocessor pH Meter pH计（HANNA公司产品）。SPSepharose Fast Flow，Sephacryl S100 Fast Flow（Pharmacia公司产品）；OP1单克隆抗体IgG(RD Systems,INC)，其余试剂均为国产分析纯。 1.3rhOP1的发酵 从E.coli pBV221 rhOP1平板上挑取单菌落接种至20 ml含0.1 mg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，30℃、200r/min活化过夜。然后接入500 ml含0.1 mg/ml氨苄青霉素的LB培养液中（接种量1%），30 ℃、200r/min过夜培养。次日将摇好的菌液接入8 L发酵罐中。当OD600升至0.7时用5×LB及30%葡萄糖进行补料，补充菌体生长所需的碳源和氮源。当OD600达到1时升温至42 ℃，诱导8h后8 000r/min速度离心15 min收集菌体。 1.4包涵体的获得及溶解 按10ml/g菌体的比例加入裂解液（20 mmol/L NaPO4，10 mmol/L EDTA，1% Tween20，pH6.0）悬浮菌体，冰浴中超声裂解菌体（功率400w，超声10s，间隔15s，重复45次）。裂解液6 000r/min离心15min后弃上清，保留沉淀，重复操作一次。用包涵体洗涤缓冲液Ⅰ（20 mmol/L NaPO4, 1%Triton, pH6.0）洗涤离心后的沉淀，悬浮混匀，8 000r/min, 离心15 min后再重复洗涤一次。然后用包涵体洗涤缓冲液Ⅱ（20 mmol/L NaPO4 , 2 mol/L Urea，pH6.0）洗涤离心后所得沉淀即为包涵体。将包涵体按1g/ml的比例悬浮于含8mol/L尿素的磷酸盐缓冲液（pH6.0），溶解4 h后8 000r/min, 离心20min，收集上清备用。 2005, 25(12)赵甜娜 等： 重组人成骨蛋白-1的离子交换及分子排阻色谱法纯化及其复性研究 中国生物工程杂志 China B