三疣梭子蟹B型清道夫受体蛋白的原核表达和细胞、组织分布.docVIP

三疣梭子蟹B型清道夫受体蛋白的原核表达及细胞、组织分布研究 杨宁1,2，周素明1，王国良1*，刘顺1，李猛1 （1. 宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室，浙江 宁波 315211；2. 青岛农业大学，海洋科学与工程学院，山东 青岛 266109） 摘要： B型清道夫受体是清道夫受体超家族成员，可识别多种配体，在机体脂类转运及免疫防御过程中发挥重要作用。为深入研究三疣梭子蟹B型清道夫受体（Pt-SRB）的功能，本研究在前期工作基础上构建了Pt-SRB胞外结构域原核表达载体，并成功获得了重组蛋白rPt-SRB。利用亲和层析方法获得纯化的rPt-SRB，并将纯化rPt-SRB蛋白免疫大鼠获得抗rPt-SRB重组蛋白免疫抗血清以用于后续研究。SDS检测发现，体外诱导表达重组rPt-SRB以包涵体的形式出现在大肠杆菌BL21裂解液的沉淀中，分子量大小约为49.18kD。Western-Blot分析表明，大鼠抗rPt-SRB血清能与rPt-SRB特异性结合。本研究还利用免疫荧光技术，对Pt-SRB在三疣梭子蟹血淋巴细胞的定位及不同组织中分布进行研究。研究结果表明Pt-SRB在三疣梭子蟹消化道、肝胰腺、鳃、心脏、肌肉组织中均有分布，但不同组织中Pt-SRB的分布不同。免疫荧光结果显示绿色荧光信号在消化道及腺体结缔组织中较强，另外在肝小管上皮、鳃丝上皮细胞亦有较强的阳性信号，表明Pt-SRB蛋白在上述组织结构中分布较广；在血淋巴细胞中，绿色荧光信号主要分布于细胞质和细胞膜，在细胞核没有明显荧光信号，提示Pt-SRB在三疣梭子蟹血淋巴细胞的细胞质和细胞膜上表达。本结果将为三疣梭子蟹B型清道夫受体蛋白的生理及免疫学功能的研究奠定基础。 关键词：三疣梭子蟹；B型清道夫受体；原核表达；组织分布 中图分类号：Q 786; S 917.4 文献标志码： A 三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)俗称白蟹、枪蟹，隶属于甲壳纲(Crustacea)，十足目(Decapoda)，梭子蟹科(Portunidae)，梭子蟹属(Portunus)，是一种重要的海产经济蟹类，广泛分布于中国、日本、朝鲜及马来西亚群岛等海域[1]。因其养殖产量较高，利润丰厚，现已成为中国沿海地区重要的养殖品种。然而，随着养殖规模的不断扩大以及养殖集约化程度的不 收稿日期： 修回日期： 资助项目：宁波市海洋蟹类产业科技创新团队项目（2011B81003）；宁波大学“水产”浙江省重中之重开放基金（xkzsc1404） 通讯作者：王国良，E-mail: wangguoliang@nbu.edu.cn 断提高，其病害日趋严重，特别是由病毒、细菌、真菌、寄生虫等引起的疾病频频爆发，严重影响了三疣梭子蟹养殖产业的健康发展[2-4]。三疣梭子蟹是低等的海洋无脊椎动物，缺乏后天免疫系统，其抵御病原微生物主要依赖其先天性免疫系统。从三疣梭子蟹机体的免疫系统着手，深入研究其先天性的免疫防御机制，并探讨提高三疣梭子蟹抗病力的有效途径和方法，改良种质并培育抗病品系，是保持三疣梭子蟹养殖业健康可持续发展的必经之路[5]。 清道夫受体（scavenger receptor）是在20世纪七十年代末由Brown和Goldstein等人发现的一种以氧化型低密度脂蛋白为配体的受体蛋白，在机体的脂类代谢和转运过程中发挥重要作用[6,7]。随着研究深入，研究者发现哺乳动物的清道夫受体超家族蛋白同样行使模式识别受体（pattern-recognition receptors， PRRs）功能，在先天性免疫系统中发挥重要作用[8-10]。B型清道夫受体是清道夫受体超家族的重要成员之一。该受体属于 = 3 \* ROMAN III型跨膜蛋白，所有B型清道夫受体均有2个跨膜区、1个含有多个糖基化位点的loop状胞外结构域及2个胞内多肽尾巴组成[8]；其中细胞外loop状结构负责结合并识别不同的配体包括脂蛋白、死亡细胞碎片及各种不同的微生物病原模式分子（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）[8-10]，而胞内肽段则负责信号转导[11, 12]。因此，B型清道夫受体是一种多功能的受体蛋白，在机体生理、病理及先天性免疫过程中具有重要作用[10, 13]。近几年，研究者在无脊椎动物中也发现了B型清道夫受体的存在。在果蝇中，至少有5种不同功能的B型清道夫受体被鉴定[14,15]。然而在海洋无脊椎动物中有关B型清道夫受体研究的报道非常有限，在甲壳动物中的相关研究则更少，仅日本囊对虾报道了两种类型的B型清道夫受体 [16,17]，2016年作者等在三疣梭子蟹中克隆获得B型清道夫受