牛樟芝se原核表达载体构建及重组蛋白的表达纯化-江苏农业科学.PDF

— ５０— 江苏农业科学　２０１７年第４５卷第１６期 李　晶，李芳娜，林雄杰，等．牛樟芝ｓｅ原核表达载体构建及重组蛋白的表达、纯化［Ｊ］．江苏农业科学，２０１７，４５（１６）：５０－５３． ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１７．１６．０１１ 牛樟芝ｓｅ原核表达载体构建及重组蛋白的表达、纯化 １，３ １ ２ １，３ １，３ 李　晶 ，李芳娜 ，林雄杰 ，王锦锋 ，林占? （１．国家菌草工程技术研究中心，福建福州３５０００２；２．福建省农业科学院果树研究所，福建福州３５０００３； ３．福建农林大学菌草研究所，福建福州３５０００２） 　　摘要：鲨烯环氧酶（ｓｑｕａｌｅｎｅｅｐｏｘｉｄａｓｅ，ＳＥ）是多数中草药植物、药用菌中三萜合成途径中的限速酶，能影响三萜含 量的积累。构建了牛樟芝鲨烯环氧酶基因（ｓｅ）原核表达载体，并进行其重组蛋白诱导表达条件优化。以牛樟芝ｃＤＮＡ 为模板扩增ｓｅ，纯化后将其克隆到ｐＭＤ１８－Ｔ载体上，筛选阳性克隆并将其连接到原核表达载体ｐＥＴ２８ａ，构建重组质 ４ 粒ｐＥＴ－２８ａ－ｓｅ，经酶切验证后转化Ｅ．ｃｏｉｌＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞进行诱导表达，利用Ｌ（３）正交试验优化目的蛋白 ９ 诱导表达条件及纯化。结果表明，不同正交处理间的蛋白表达差异显著（Ｐ＜０．０５），其诱导因素的主次为时间＞温 度＞ＩＰＴＧ浓度，诱导时间对重组蛋白表达影响最显著（Ｐ＜０．０５）。而ＩＰＴＧ浓度和温度对重组蛋白表达影响并不显著 （Ｐ＞０．０５），且当ＩＰＴＧ终浓度为０．２ｍｍｏｌ／Ｌ，诱导时间为７ｈ，诱导温度为２６℃时，对ＳＥ重组蛋白的诱导效果最佳。 　　关键词：牛樟芝；鲨烯环氧酶；原核表达；正交设计 ＋ 　　中图分类号：Ｓ５６７．３９０．１　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０１７）１６－００５０－０４ 　　三萜是多数食药用菌和药用植物中重要的活性物质之 优点，但是外源蛋白的表达效率，受到培养时间、培养温度和 一，研究表明三萜具有保肝、抗炎症、抗过敏和抗肿瘤等功效， 诱导剂等因素的影响差别较大［１１］，为在体外获得牛樟芝 ＳＥ ［１］ 因此具有显著 的经济效益 。鲨烯环氧酶 （ｓｑｕａｌｅｎｅ 蛋白表达的最佳条件，将 ｐＥＴ２８ａ－ｓｅ重组质粒导入 Ｅ．ｃｏｉｌ ｅｐｏｘｉｄａｓｅ，ＳＥ）是三萜合成途径中的一种重要调控酶，它位于 ＢＬ２１（ＤＥ３）中，利用异丙基－ －Ｄ－硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）、 β 内质网的微粒体中，催化鲨烯（ｓｑｕａｌｅｎｅ，ＳＱ）合成２，３－氧化 诱导时间和诱导温度进行筛选，通过正交试验优化诱导条件， 鲨烯（２，３－ｏｘｉｄｏｓｑｕａｌｅｎｅ），可进一步合成三萜、甾醇、胆固醇 筛选出牛樟芝ｓｅ原核表达最佳条件，为进一步探讨牛樟芝ＳＥ ［２－３］ 等重要萜类物质 。同时，ＳＥ也催化氧原子插入到 Ｃ－Ｃ 蛋白活性和三萜合成机制奠定基础。 ［４］ 双键在Ｐ４５０类型反应中形成环氧结构的重要酶 。目前， １　材料与方法 已在人类、动物、植物和真菌中克隆到鲨烯环氧酶基因（ｓｅ）， 王森等对中草药五味子ｓｅ的研究表明其 ｍＲＮＡ的表达量与 １．１　材料与试剂 ［５