微生物的形态观察与培养技术——产淀粉酶细菌的分离培养和观察.DOCVIP

微生物的形态观察与培养技术 ——产淀粉酶细菌的分离培养和观察 实验一 选择性培养基的制备和灭菌 一、目的要求 1.明确培养基的配制原理； 2.通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤； 3.了解高压蒸汽灭菌的基本原理以及应用范围； 4.学习高压蒸汽灭菌的操作方法。 二、基本原理 牛肉膏蛋白胨培养基的一种应用最广泛和最普通的细菌基本培养基，有时又称普通培养基，基础培养基含有牛肉膏，蛋白胨和NaCl，其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂，多用于培养基细菌，因此要用稀酸和稀碱将其pH调至中性微碱性，以利于细菌的生长繁殖。 在培养基中添加淀粉作碳源，可筛选出产淀粉酶的菌株。 高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密封的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧的将冷空气从排气中驱除尽 ，然后关闭排气，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100°C的温度 ，导致菌体蛋白凝固变性而达到灭菌的目的。 三、器材 1.实验样品：地表5cm以下土壤样品，面粉样品，小米样品 2.试剂：牛肉膏，蛋白胨，淀粉，NaCl，琼脂，1mol/L NaOH ，1mol/L HCl。 3.仪器：试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，天平，牛角匙，pH试纸，麻绳，，培养皿，酒精灯，手提式高压蒸汽灭菌锅，空气灭菌干燥箱等。 四、操作步骤 1.无菌器材准备：每组准备12套培养皿，6支1ml移液管，2个刮刀，用报纸包扎，150~170℃条件下干热灭菌2h。另准备三角瓶1个，加入99ml无菌水和玻璃珠若干包扎，取试管7支，每支加入4.5ml水，与后述培养基一同进行湿热灭菌 2.培养基的配制与灭菌 1~4组配制试管斜面培养基，准备试管50支，共配制500ml培养基分装。5~8组配置平板固体培养基，准备三角瓶8个，瓶内加入琼脂（按200ml培养基计算），共配制1600ml培养基进行分装。 2.1 称量 按培养基配方比例依次准确称取牛肉膏，蛋白胨， NaCl放入烧杯中，牛肉膏用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿称量，用热水溶化后倒入烧杯 ，也可放称量纸上，称量后直接放入水中，稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。 2.2 溶化 在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻璃摇匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，或在磁力搅拌溶解。将药品完成溶解后，补充水到所需总体积。 2.3 调节pH 在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，用1mol/L HCl进行调节。 3.4分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或者三角烧瓶内。 3.5 加塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。 3.6 包扎 加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用容易解开，同样用记号笔注明培养基名称，组别，配制日期。 3.7 灭菌 将将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜，放回内层锅，并装入培养基，加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，加热，0.103MPa，121°C并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气，待冷空气完全排尽后，关闭排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升；当锅内压力升到所需压力时，维持压力至所需时间。20min后，切断电源或者关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，开盖取出物品。 3.9 倒平板、搁置斜面 将灭菌的试管培养基冷至50°C左右，将试管口端搁置在玻棒或其它合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的2/3为宜。每组倒固体平板12个。 4. 样品稀释分离与接种 4.1 编号 ??? 取无菌平皿6套，分别用记号笔表明10-4、10-5、10-6（稀释度）各2套。另取4只盛有4.5ml无菌水的试管，编号依次是10-3、10-4、10-5、10-6。 4.2 稀释 ??? 用1ml无菌吸管吸取1ml已充分混匀的样品悬液，精确地放0.5ml至10-3的试管中，此即为10倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。将10-3试管置试管震荡器上震荡，使菌液充分混匀。另取一只1ml吸管插入10-3试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。用此吸管吸取0.5ml