课程教学改革与实践室操作技术指导-北京林业大学生物学教学.PDFVIP

野生动物研究法-课程教学改革与实践 实验室操作技术指导 鲍伟东 高福利 北京林业大学生物学院 2010 年 12 月 1 目录 实验一 动物DNA 的提取 3 实验二 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 8 实验三 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测外源蛋白的表达 10 实验四 PCR体外扩增DNA片段与扩增产物的检测分析 错误！未定义书签。 实验五 从琼脂糖凝胶中回收DNA片断 错误！未定义书签。 实验六 目的基因片段与载体连接 错误！未定义书签。 实验七 RAPD和ISSR技术 20 实验八 SSR简单序列重复标记 22 实验九 PCR 单链构象多态性分析 错误！未定义书签。 实验十 DNA指纹图谱分析 24 实验十一 动物总 RNA 的提取及含量测定 ………………………………………… 27 实验十二 动物组织mRNA 提取实验方法……………………………………………..34 实验十三 RNA 的定量和完整性分析………………………………………………….35 实验十四 综合实验：逆转录 PCR …………………………………………………….38 附录：常用缓冲液的配置………………………………………………………………41 2 实验一 动物 DNA 的提取 一、 新鲜组织DNA 的提取 1. 实验原理 生物组织中的DNA是以核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中，提取前首先应粉碎组织，裂 解细胞膜和核膜，使DNP 释放出来，再用苯酚提取蛋白。由于细胞中的核糖核蛋白(RNP) 和DNP 往往一起被提取，DNA 沉淀中混有RNA 。需用核糖核酸酶(RNase)处理，去除RNA 。 并用蛋白酶将遗留的少量蛋白质水解除去，再经苯酚处理，乙醇沉淀，最后可得较为纯净的 DNA 。它的纯度可以从260nm波长处的光密度和280nm 波长处的光密度之比值测知，一般 以O.D260nm ／O.D280nm 能达到1.8 左右为标准。 DNA 的定量可采用化学的定磷法、定核酸法。目前多数实验室采用紫外分光光度法测 定核酸含量，以下公式可作为紫外定量时参考：双链DNA 含量：O.D260nm ×样品稀释倍 数×50ug ／ml= ug/m1 样品。 2. 试剂及器材 1）．塑料离心管：6 2 ）．刻度离心管：1 3 ）. 滴管：长： 1 吸酚：氯仿混合液 中： 1 吸乙醇 短(钝口) 1 吸DNA 水溶液 4 ）．细玻棒：1 5 ）．移液管：1 6 ）．微量取样器1 7 ）．手套：1 副 8 ）．离心机 9 ）．紫外分光光度计 10）．37℃水浴，50℃水浴 11）．组织捣碎器 12）．电泳仪及电泳槽 13）．裂解缓冲液： 50mmol ／l Tris—Hcl pH7.4 20mmol/lEDTA、 0.5 ％SDS 100mmol/l NaCl （1 mol/l Tris-HCl pH7.4 50ml ，20 ％SDS 25ml， 2mol/l NaCl 50ml，0.5mol/l EDTA 40ml，蒸馏水稀释至 1000ml） 其中Tris-Hcl pH7 ．4 维持PH 恒定，防止DNA 变性和水解。EDTA 能络合二价金属离 子，当Mg+ ’被络合后，细胞内释放出来的DNA 酶的作用被抑制，以避免DNA 的降解， 同时金属离于络合后，细胞膜的稳定性下降，有利于膜的裂解；SDS 有使蛋白质变性的作 用，它能破坏膜蛋白的构象，因此使膜裂解，它又能使核蛋白中的核酸与蛋白质解离，并且