实训二培养基的制备与灭菌试验目的1熟悉常用培养基的制备.DOC

实训二 培养基的制备与灭菌 一、 实验目的 1. 熟悉常用培养基的制备流程及各环节的操作要领 2. 了解培养基配方中各成分的作用 3. 掌握高压蒸气灭菌原理、操作关键技术 二、 实验原理 1. 培养基的制备原理 培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组分的营养物质调制而成的营养基质。人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个良好的营养条件。把一定的培养基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的环境和场所。它含有满足微生物生长发育的水分、碳源、氮源、无机盐和生长素以及某些特需的微量元素等。此外，培养基还应具有适宜的酸碱度(pH值)和一定缓冲能力及一定的氧化还原电位和合适的渗透压。 固体培养基是在液体培养基中添加凝固剂制成的，常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅酸钠，其中以琼脂最为常用，其主要成份为多糖类物质，性质较稳定，一般微生物不能分解，故用凝固剂而不致引起化学成份变化。琼脂在95℃的热水中才开始融化，融化后的琼脂冷却到45℃才重新凝固。因此用琼脂制成的固体培养基在一般微生物的培养温度范围内(25℃～ 2. 高压蒸气灭菌原理 高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。 在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。 在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。 三、 实验器材 牛肉膏、蛋白胨、试管、量筒、小烧杯、玻璃棒、药匙、pH试纸、纱布、棉花、报纸、麻绳、标签、培养皿、琼脂、1M HCl、1M NaOH、高压蒸汽灭菌锅、烘箱、电炉等。 四、 操作步骤 1. 称量：按照培养基配方，准确称取各成份放于烧杯中。 2. 熔化：向上述烧杯中加入所需水量，搅匀，然后加热使其熔解。如是配制固体培养基，在琼脂熔化的过程中，需不断搅拌并控制火力不要使培养基溢出或烧焦，待完全熔解后，补充所失水分。如果配方中含有淀粉，则需要将淀粉用少量冷水调成糊状并在火焰上加热搅拌后加足水份及其他药品，待完全熔解后，补充水份。 3. 调PH值：初制备好的培养基往往不能符合所要求的PH值，故用1M HCl 或1M NaOH 调PH至所需范围。 4. 过滤：用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求的情况下这一步可以省去。 5. 分装：根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管内或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上以免浸湿棉塞，引起污染。 1）液体分装 分装高度以试管高度的1/4左右为宜，分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的1/2为宜。 2）固体分装 分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，斜面长度不超过管长的1/2。分装三解瓶，以不超过容积的1/2为宜。 3）半固体分装 装置以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。 6. 加棉塞： 分装完毕后，在试管口或三解瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试管帽等，以阻止外界微生物进入培养基而造成污染，并保证有良好的通气性能。 7. 包扎： 棉塞头上包一层牛皮纸，扎紧，即可进行灭菌。高压蒸汽灭菌锅的使用操作步骤见实训一。 8. 保存：灭菌后的培养基放入37℃养箱中培养24小时，以检验灭菌的效果，无污染方可使用。