第十高效液相色谱分析.pptVIP

* 该方法的几个突出特点： (1)高压： 液相色谱以液体作为流动相(称为载液)，液 体流经色谱柱受到的阻力较大，为使载液迅 速通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般 可达到150~300kg/cm2。 (2)快速： 由于使用了高压，HPLC所需的时间较之经典 液相色谱短得多，如分离苯的羟基化合物七 个组分，只需1分钟；对氨基酸的分离， 经典液相色谱需用20小时才能分离出20种氨基酸，而HPLC只需1小时即可完成。载液在色谱柱内的流速可达1~10mL?min-1。 (3)高效： 气相色谱的柱效（n值）约为2000塔板/m，而高效液相色谱约为5000塔板/m以上；一根高效液相色谱柱可同时分离多达100种以上的组分。 (4)高灵敏度： 由于在HPLC中使用高灵敏度的检测器，如紫外检测器的最小检测量可达10-9g，荧光检测器 可达10-11克；所需试样为微升级。 HPLC与GC相比较的突出优点： ? 用GC法分析样品须先气化，目前已知的有机 物中，能直接采用GC法进行分析的仅占20%。 而HPLC法则不受此限制，尤其适合于分析生 物、医学方面的大分子及离子型化合物。 ? HPLC方法中，有两个相与样品分子相互作用 ，而GC方法中一般认为只有一个相与样品分 子相互作用。所以HPLC的选择性大大提高。 ? HPLC方法中，因为在常温下进行分析，因此 固定相的选择比GC多；另一方面可提高色谱 的分离效率。 ? HPLC方法中，可使用灵敏度较高的光度检测 器，而在GC方法中则无法使用。 ? HPLC方法中，样品可以回收，而GC方法中样品 回收则较困难。 §10-2 HPLC色谱仪 高效液相色谱仪的结构如下： 由贮液瓶、高压泵(梯度洗提装置)、进样器、色谱柱(恒温器)、检测器和记录仪组成。 主要部件简述： 1.高压泵 其作用是输送载液(流动相)。由于色谱柱很细 (1~6mm)，填充剂粒度小(几十微米)，因此要 达到快速高效的分离效果，要求压力为150~ 200kg/cm2。 2.梯度洗提装置 又称梯度洗脱(gradient elution)和气相色谱 法中的程序升温类似，对复杂混合物的分离带 来方便。 　所谓梯度洗提，指载液中含有两种或两种以上不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续改变载液中各溶剂的配比。由此通过改变载液的极性来达到分离组分，提高分离效果。 3.进样装置 　因为流路中为高压力工作状态，通常使用耐高 压的六通阀进样装置。 4.色谱柱 常用的标准柱型是内径4.6或3.9mm，长度为15~30cm的直形不锈钢管。填料粒度5~10?m，柱效以理论塔板数计大约7000~10000。其发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 5.检测器 常用的检测器： (1)紫外光度检测器(UV)： 它的作用原理是基于被分析试样对特定波长紫外光的选择性吸收。池内样品浓度与吸收的光强度服从比耳定律。P.304. 最小检测量为10-9g?mL-1，对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。 紫外检测器的缺点：不适用于紫外光完全不吸收的试样，溶剂的选用也受到一定的限制。 光电二极管阵列(photo-diode array detector)检测器是紫外检测器的重要进展。1024个二极管阵列，各检测特定波长，通过计算机快速处理，形成三维立体谱图，如图所示。 (2)差示折光检测器： 偏转式差示折光检测器光路图 光源1射出光线由透镜2聚焦,透过遮光板4的狭缝,经反射镜5反射后,由透镜6汇聚两次,穿过工作池7和参比池8 该检测器是继UV检测器之后，第二种广泛使用的液相色谱检测器。图示： 被平面反射镜9反射出来，成像于棱镜11的棱口上，光束均匀分为两束，到达对称的光电管12上。 如果工作池和参比池皆通过纯流动相，光束无偏转，左右两个光电管的信号相等； 如果工作池中有试样通过，由于折射率改变，造成光束偏转，从而使到达棱镜的光束偏离棱口，左右两个光电管接受的光能量不等，其差值正比于试样的浓度。 每种物质都有各自不同的折射率，因此都可用差示折光检测器进行检测，所以是一种通用型的浓度检测器。灵敏度为10-7g?mL-1。 缺点：对温度变化很敏感，此检测器不能用于梯度洗提。 §3-3 HPLC的理论基础简述 高效液相色谱法的理论基础基本与气相色谱法相同，但有其不同之处。两者的主要区别在于流动相的不同。 根据速率理论，HPLC中影响柱效的因素如下： 涡流扩散项He He=2?dp 其含义与气相色谱法相同。 2.纵向扩散项 Hd