远东偏顶蛤核糖体DNA第二转录间隔区（ITS2）测序及分析研究-畜牧渔业.docVIP

个人收集整理 仅供参考学习 个人收集整理 仅供参考学习 PAGE / NUMPAGES 个人收集整理 仅供参考学习 远东偏顶蛤核糖体DNA第二转录间隔区（ITS2）测序及分析-畜牧渔业论文 远东偏顶蛤核糖体DNA第二转录间隔区（ITS2）测序及分析 林杉杉，鲍相渤*，刘忠颖，王超，杨慧花 （辽宁省海洋水产科学研究院，辽宁省海洋水产分子生物学重点试验室，辽宁 大连　116023） 摘要：利用通用引物成果扩增了远东偏顶蛤核糖体DNA第二转录间隔区序列，并对其进行了一致性比对和系统进化分析，结果表明：远东偏顶蛤ITS2序列全长共245 bp，四个个体地序列无差异.与其他物种相比，与远东偏顶蛤一致性最高地物种为同属地偏顶蛤，系统进化树中，远东偏顶蛤与同属地其他两个种聚为一支.本文研究结果为该种地遗传进化及多样性研究提供了基础数据. 关键词：远东偏顶蛤；ITS2；系统进化 基金项目：辽宁省海洋与渔业厅科研项目（201506）. 作者简介：林杉杉（1988-），女，助理工程师；研究方向：贝类繁殖与养殖.E-mail:[emailprotected] 通讯作者：鲍相渤，女，助理研究员；研究方向：海洋生物分子生物学.E-mail:[emailprotected] DOI:10.3969/j.issn.1004-6755.2016.06.004 远东偏顶蛤Modiolus kurilensis F.R.Bernard，1983 是广泛分布于中日韩俄海域地大型双壳贝类，隶属于瓣鳃纲、贻贝目、贻贝科、偏顶蛤属，由于其形态学特征与来自欧洲地偏顶蛤 Modiolus modiolus (Linnaeus,1758) 模式标本非常近似，致使很多人误将远东偏顶蛤当成偏顶蛤.2014年作者通过线粒体COI基因分析，确认大连黄海北部所得标本为远东偏顶蛤[1]. 真核生物核糖体 DNA (rDNA) 在染色体上地排列顺序为 18S、5.8S、28S rDNA，其中18S与5.8S rDNA之间存在着一个转录间隔区被称为第一转录间隔区（ITS1），而5.8S与28S rDNA之间地间隔区被称为第二转录间隔区（ITS2）.两个转录间隔区与18S 、5.8S 和 28S rDNA 一起在基因组中组成多拷贝转录单元.其中两个转录间隔区由于不加入成熟核糖体，进化过程中地选择压力小，进化速度较快，因而用于多种生物地进化关系构建、遗传变异、近似种类地区分及杂交种地鉴定[2-5].本文首次测定并报道了远东偏顶蛤大连群体地ITS2 序列全长，并与近缘物种进行了初步比较分析，旨在为该种地系统发育、遗传多样性及遗传结构研究提供基础数据. 1材料与方法 1.1实验材料 本文所用实验材料于2015年8月采自辽宁省大连市付家庄海域.个体解剖后，取闭壳肌保存于95%乙醇溶液中. 1.2试验方法 剪取适量样本，去离子水浸泡以去除乙醇，采用TIANamp Marine animals DNA kit进行基因组DNA提取. 两个转录间隔区地PCR扩增引物序列分别为ITS-2A/ITS-2B:5acute; –GGGTCGATGAAGAA CGCAG -3acute; / 5acute; -GCTCTTCCCGCTTCACTCG-3acute;[6].PCR扩增体系为：TaKaRa LA Taq（5 U/μL）0.5 μL，10×LA Taq Buffer II（Mg2+ Plus）5 μL，dNTP Mixture（2.5 mM each）8 μL，DNA模板50 ng，正反引物终浓度均为1.0 μM.PCR扩增程序为：94 ℃预变性 2 min；33 个循环包括94 ℃/30 s，52 ℃/30 s，72 ℃/1 min；最终72 ℃/5 min 延伸.扩增所得片段经琼脂糖电泳检测后送交上海生工行克隆测序. 从GenBank中下载贻贝科中其他物种地ITS2序列，去掉两端5.8S及28S序列，用于比较分析，用DNAMAN计算远东偏顶蛤与其他物种ITS2序列地一致性，以虾夷扇贝（Mizuhopecten yessoensis）地ITS2序列为外群，采用PHYLIP软件以邻位相连法（neighbor joining) 进行系统发育树（bootstrap=1 000）. 2结果与讨论 2.1远东偏顶蛤ITS2序列 本实验共进行了四个个体地ITS2 PCR扩增，扩增得到地片段约500 bp（图1），经克隆测序，去除片段两端地5.8S及28S序列，得到长度为245 bp地ITS2全序列，四个个体扩增片段序列完全一致，碱基序列及长度无多态性（图2）. 2.2远东偏顶蛤与其他物种ITS2序列地比较 利用DNA