荧光扫描法快速检测肽核酸分子信标标记的单增李斯特菌-微生物学报.PDFVIP

微生物学报 Acta Microbiologica Sinica 2016, 56(7): 1105-1112 /actamicrocn DOI: 10.13343/ki.wsxb Research Paper 研究报告 荧光扫描法快速检测肽核酸分子信标标记的单增李斯特菌 * 吴姗，张晓峰 ，帅江冰，李可，虞惠贞，金晨晨 浙江省检验检疫科学技术研究院，浙江 杭州 310016 摘要： 【目的】建立了单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes ，单增李斯特菌) 的肽核酸 (Peptide nucleic acid, PNA)分子信标(Molecular beacon)的荧光扫描检测方法，以简化普通PNA原位荧光杂 交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)检测方法中显微镜观察步骤。【方法】在具有单增李斯特菌特 异性的肽核酸探针的5′和3′分别标记报告荧光基团和淬灭基团形成分子信标PNA探针，利用FISH技术和 荧光扫描技术对单增李斯特菌进行检测。【结果】用普通PNA探针进行荧光扫描检测时，以N1处理为空 白对照，假阳性率11.4%，假阴性率为0 ；以N2处理为空白时，假阳性率降低至4.3% ，但假阴性率上升 为18.6%。用分子信标PNA探针进行检测时，用N1为空白对照时，假阳性率8.6% ，假阴性率为1.4%；以 N2处理作为空白时，假阳性率5.7% ，假阴性率为1.4%。与普通探针比较，分子信标PNA探针能有效减 少假阳性和假阴性的发生。2种普通PNA探针的杂交成功率分别为83.3%和95.2% ；2种“分子信标化”的肽 核酸探针的成功率分别为91.7%和90.5% ，表明探针两端标记并不会降低与目标菌的杂交成功率。【结论】 将液相PNA-FISH和荧光扫描技术结合，通过大通量快速的荧光扫描检测可大幅提高检测效率。同时将 肽核酸探针分子信标化，有效的降低了荧光扫描结果的假阳性，并通过了N1 和N2两种空白对照处理把 假阴性控制在较低的范围。 关键词：肽核酸荧光原位杂交, 分子信标, 荧光扫描, 单增李斯特菌 单核细胞增多性李斯特菌是李斯特菌属中人 在医学诊断及食品微生物检测中，对单增李 畜共患型的食源性致病菌。感染后常表现为脑膜 斯特菌的检测除了通常使用的培养方法外[如 脑炎、脑炎、骨髓炎、心肌炎、脓血症、流产 ISO标准11290, 1996 (11290-1), 1998 (11290-2)和 等，对婴儿及免疫力低下的人群致死率高达 2004 (11290-1修订版1)]，还开发了一系列的生物 [1–4] 54%–90% 。该菌在自然界中广泛分布，环境适应 化学方法、免疫学方法和分子生物学方法等 。 性很强，可通过多种途径进入食品加工和生产过 荧光原位杂交法是基于微生物细胞中16S或23S [1] 程污染食品，对消费者健康构成潜在威胁 。 rRNA 的高拷贝数和不易受环境影响的稳定性，而 基金项目：国家质量监督检验检疫总局科研项目(2013IK189 ，2015IK