植物生物技术研931-分子克隆.ppt

2.1 分子克隆的内涵 克隆的概念 纯系、无性系 一种人工诱导的无性繁殖方式 DNA克隆 目的：建立繁殖目的基因的细胞系 含义：建立目的DNA分子繁殖体系的过程 三个要素: 目的基因、载体、受体细胞 载体的特征（应具备的条件） 具有对受体细胞的可转移性 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 长度尽可能小，以提高其载装能力 具有多种单一的酶切位点 具有合适的选择性标记 质粒的基本特性 自主复制性携带有自己的复制起始区（ori） 一个控制质粒拷贝数的基因； 能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制 可转移性在天然条件下，有些天然质粒都可以通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内 要素：移动基因mob 转移基因tra 转移起始位点bom 内部的转移缺口位点 nic 人工构建的载体质粒 多拷贝 复制子经过人工突变，除去控制拷贝数负调节基因，使质粒拷贝数达到每个细胞数千，用于扩增外源基因 整合质粒 装有整合促进基因整合特异序列，便于外源基因准确重组整合入受体细胞的染色体上 穿梭质粒 含有两个不同的复制子，能在两种不同的受体细胞中复制 表达载体 装有强的启动基因，合适的顺序以及有效的终止子，以便任何外源基因在受体细胞内的高效表达 pBR322 该质粒具有以下优点 分子大小4363bp 含有2个抗生素抗性基因，可以作为选择标记。而且每一个标记基因都含有单一的酶切位点，可以插入DNA，amp基因内可被Pst I, Pvu I, Sac I切开，而四环素抗性基因可被BamH I, Hind III切开，通过插入失活筛选重组子。 受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到15个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下如氯霉素，可达到1000-3000拷贝。 质粒的制备 实验室常采用碱法制备质粒 二 λ DNA载体 λ噬菌体由外壳蛋白和λ-DNA组成； λ-DNA为线状双链DNA分子，两端各有一个12核苷酸的互补单链（粘性末端），称为cos区，全长48.5kb。 噬菌体通过特殊的生物学方式将其DNA导入宿主细胞 吸附： ?注入DNA： λ－DNA载体 插入型载体 经改造后的长度为37 kb，为包装的下限，它本身也能被包装，其 允许的插入片段最大为13.9kb（50.9-37kb） 由于该类载体重组与否均可包装，因而为区分重组子与非重组子必须携 带标记基因。 基因 cI 失活 基因cI 是λ 噬菌体的抑制基因，与操纵区oR和oL结合，全面抑制并阻 断基因的表达。 三 考斯质粒（粘粒，cosmid） c2RB 6.8kb ， 含两个 cos 位点，在 cos 位点之间有一个卡那霉素抗性基因。由于含有 cos 位点的1.7kb 的片段在包装过程中将会消失，因此该载体的装载容量与 pJB8 一样为 33~46.5kb。 Supercos-1 7.94kb ，含有在真核细胞中起作用的SV40 的复制起点 ori-SV40 和新霉素抗性基因（neor）。阳性重组子可方便的转移到动物细胞中增殖。 The decision to enter the lytic cycle or the lysogenic state is controlled by two regulatory genes, cI and cro. 载体的应用得益于体外包装系统 J基因到N基因之间的DNA序列对噬菌体的生长不是绝对必需的 ，可以缺失或被外源基因取代，P基因与Q基因之间的序列缺失也仍然可以作为噬菌体使用。 Insertion λ vectors Lambda vectors used for making cDNA libraries do not require a large insert capacity (most cDNAs are 5 kb long). Design of insertion vectors often involves modification of the λ genome to permit insertional cloning into the cI gene 取代型载体该类载体经改造后的长度约为40kb，在非必需区域内含有两个相同的 酶切位点（如EcoRI、HindIII、或saλI），两者间的距离为14kb长，使用时用酶切开，分离去除这个14kb长的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。 40-14kb=26kb，小于包装下限（36.4kb），因此其载装下限为10.4