1-细胞生物学实验技术课程设计.pptVIP

* * (3)转动转换器，使相差物镜(20×)对准标本，同时转动环状光阑转盘选用20×标示孔的光阑，以使环状光阑的直径和孔宽与所使用的相差物镜相适应，用细调节器调节焦距，使物像清楚。 (4)合轴调节。将合轴望远镜换入目镜筒内，一边向望远镜内观察，一边用右手转动望远镜内筒使其下降，当对准焦点就能看到环状光阑的亮环和相板的黑环，将望远镜固定，升降聚光器并调节其下的螺旋使亮环的大小与黑环一致，然后前后左右调节环状光阑聚光器上的调节钮，使两环完全重合。 * * 五、注意事项 1、载玻片或培养瓶必须平整、均匀，标本不能太厚，否则相差显微镜成像效果不好； 2、标本要在有水的环境中（如培养液或用水封片）成像效果才明显。 六、实验结果与分析 在倒置相差显微镜下观察活细胞，可清楚地分辨细胞的内部结构，细胞边界、细胞核、核仁以及胞质中存在的颗粒状结构清晰可见，分裂期细胞可见期染色体。 第三节 荧光显微镜的构造及使用方法 * * 一、原理与应用 * 1、荧光的产生 一些化学物质经短波高能光激发后能吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量以荧光的形式发射。荧光发射的特点是在接受能量后即刻引起发光，而一旦停止供能荧光现象随之瞬间消失。各种荧光分子有其特定的吸收光谱；光谱(荧光光谱)，即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰，因此要观察不同的荧光应选用不同波长的激发光，得到的荧光强度才能最大。 * * 有些物质能够自发荧光，如维生素A的红色荧光、胶原纤维的蓝绿色荧光、绿色荧光蛋白(GFP)的绿色荧光；有些物质不能够自发荧光，用荧光染料染色后，结合物可发出荧光。 荧光染料 激发光 荧光颜色 应用范围 溴化乙锭（EB） 蓝紫 红 DNA HO33258 紫外 蓝白 DNA 吖（ā）啶橙（AO） 蓝光 绿(DNA)、红(RNA) DNA、RNA 派洛宁Y 绿光 红 RNA 异硫氰酸荧光素（FITC） 蓝光 黄绿 蛋白质、抗体标记 四乙基罗丹明 绿光 橘红 抗体标记 四甲基异硫氰酸罗丹明 绿光 橘红 抗体标记 二乙酸酯荧光素（FDA） 蓝光 绿 细胞脂酶、细胞活力 芥子阿的平（QM） 紫外 蓝白 染色体分带 表1-2 常用的荧光染料 * * 2、荧光显微镜原理 荧光显微镜采用高压汞灯作光源。汞灯是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定数量的汞。工作时由两个电极间放电，引起汞蒸发，球内气压迅速升高，当汞完全蒸发时，可达5~7MPa，这一过程一般约需5~15min。超高压汞灯的发光是电极间放电使汞分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果，它发射紫外到红色各色光，其中强紫外和蓝紫光等短波光足以激发各类荧光物质。 光源发出的光经过激发滤片后，选择性地透过可使标本产生荧光的特定波长的短波激发光，同时阻挡对激发荧光没有用的光，短波激发光激发标本内的荧光物质发射出荧光，通过物镜和目镜放大，同时目镜前的阻断滤片阻挡掉没有被标本吸收的激发光，有选择的透过荧光，从而使观察者通过目镜可观察到清晰的荧光。 * * 目前常用的落射式荧光显微镜的光路如右图。高压汞灯发出的光经激发滤片选择后，激发光一个与光轴呈45°角的双色束分离器从物镜向下落射到标本表面，样品被激发产生的荧光以及盖玻片反射的激发光同时进入物镜，荧光可通过双色束分离器进入目镜，反射的激发光被双色束分离器阻挡，少量通过双色束分离器的激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片/双色束分离器/阻断滤片的组台插块，可满足不同荧光物质的需要。 1 2 3 4 5 6 7 8 1-高压汞灯；2-激发光片；3-目镜；4-阻断滤片； 5-双色束分离器；6-物镜； 7-标本；8-载物台 * * 3、荧光猝灭 荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。因此荧光物质的保存应注意避免光（特别是紫外光）的直接照射和与其他化合物的接触。 * 荧光显微镜比普通光学显微镜多一些附件，如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等。 光源 普遍采用100~200W的超高压汞灯，它能发射很强的光，如紫外、蓝光、绿光等，足以激发各类荧光物质。此外荧光显微镜一般同时也配有普通光源，以方便标本上观察目标的寻找。 * * 二、仪器构造 滤色系统 滤色系统由激发滤片和阻断滤片组成。 (1) 激发滤片 透过能使标本产生荧光的特定波长的光，同时阻挡对激发荧光无用的光。一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片，各自提供一定波长范围的激发光。 U组：紫外激发滤片，激发波长3