基于适配体信号放大技术的沙门氏菌快速检测方法的研究-生物学·微生物学专业论文.docxVIP

摘要沙门氏菌是一类常见的肠杆菌科革兰氏阴性致病菌，它不仅危害 摘要 沙门氏菌是一类常见的肠杆菌科革兰氏阴性致病菌，它不仅危害 人类健康，还会对畜牧业造成巨大的经济损失。沙门氏菌对人类健康 的威胁主要表现为能引起伤寒和副伤寒，急性肠胃炎，菌血症和败血 症等。对畜牧业的危害主要表现在可引起鸡，猪，牛等饲养的动物大 面积患病甚至死亡。由于沙门氏菌能造成如此大的危害，如何实现对 其进行快速有效的检测一直是相关领域的热点研究问题。 适配体是利用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)从核酸文 库中经过若干轮体外筛选得到的能与靶标进行特异性结合的一段DNA 或RNA序列。由于适配体具有靶标物质范围广，特异性及亲和力高， 筛选周期短等诸多优点，使得其已在多个领域得到了应用。石墨烯是 一种新发现的碳纳米材料，由于具有独特的二维平面结构、理想的理 化性能，使其在医疗、机械、电子等高技术领域都有广阔的应用前景。 杂交链式反应(HCR)是一个不需要酶参与就能扩增DNA的反应过程， HCR简便温和的反应条件使得其广泛应用于生物传感器的信号放大作 用。 本论文以肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的快速高效、高灵敏 度、高特异性检测为研究目的，主要开展了以下工作： (1)设计了一种基于纳米材料氧化石墨烯和适配体探针对肠炎 沙门氏菌进行检测的生物传感器。氧化石墨烯淬灭荧光和吸附单链核 酸适配体，通过适配体与靶标的16S rRNA之间的特异性互补配对， 将适配体探针拉离氧化石墨烯以恢复荧光信号。同时，适配体探针3’ 万方数据 端的发卡结构双链末端在Klenow酶的作用下延伸将靶标序列置换下 端的发卡结构双链末端在Klenow酶的作用下延伸将靶标序列置换下 来，使靶标循环参与反应而放大信号，此外，同时使用FAM和SYBR Green I两种荧光染料产生协同效应使荧光信号进一步放大。通过以 上双重荧光信号放大的共同作用，该传感器检测灵敏度得到极大提 高，对靶标序列的检出下限为60pM，对实际样品中的肠炎沙门氏茵 检出下限为i02 CFU·mL～。除此之外，更改探针序列，该传感器还可 以检测其他的靶标物质，具有很大的应用潜力。 (2)利用杂交链式反应(HCR)放大信号，设计了一种使用适配 体对鼠伤寒沙门氏菌进行快速、简便、特异性检测的方法，适配体与 靶标特异性结合将暴露出引发序列从而起始HCR反应。杂交链式反应 具有不需要酶参与，全程可以在等温条件下进行，反应条件温和等优 点，简化了检测流程与设备需求。试验结果证明，该检测方法可快速 完成对鼠伤寒沙门氏菌的检测，并可排除其他沙门氏菌属细菌的干 扰，检测下限为103 CFU·mL～，检测范围为103-108 CFU·mL～。如果 更换适配体序列，该检测方法可应用于对其他靶标的检测，具有较大 应用价值。 关键词：沙门氏茵，适配体，石墨烯，杂交链式反应，生物传感器 万方数据 AbstractAs Abstract As a group of common gram-negat ive pathogeni c bacteria， Salmonella threaten human health and bring tremendous economic loses to the livestock industry．It can not only cause typhoid fever， acute gastroenteritis， bacteremia and septicemia， but also cause widespread infection even death of livestock． Therefore，effective and efficient detection of Salmonella has been a hotspot in the cl inic microbiology． Aptamer i s a short DNA or RNA sequence derived from a random nucleotide library via systematic evolution of ligands by exponential enrichment(SELEX)．It can specifically bind to a certain target．Since it has many advantages l ike broad spectrum of targets，high specificity and affinity，short period of screening cycle，aptamer has been appl ied to many fields