第二章-纯培养和显微技术.pptVIP

目的和要求： 本章主要使大家熟练掌握无菌技术、纯种分离技术，并对显微镜的结构、种类、原理和显微观察技术有初步了解 重点、难点 ： （1）微生物学实验操作的最基本的无菌技术 （2）掌握微生物的分离、纯化及纯培养技术。 （3）熟练使用普通光学显微镜，理解提高光学显微镜分辨率的原理。 紫外线 杀菌效率与照射强度和时间的成积成正比 化学消毒剂熏蒸灭菌 霉菌较多先用5%石碳酸喷洒，再用甲醛熏蒸 细菌较多乳酸和甲醛交替熏蒸 超净工作台的灭菌 微生物的纯种分离： 从多种混杂的微生物中，经某种技术或方法获得单一菌株的过程。 微生物的纯培养物（pure culture)： 一株菌种或一个培养物中的所有细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代 纯种分离的原理和方法 个别细胞较大细菌 固体平板不能长菌落 原生动物、藻类 接种物用液体培养基顺序梯度稀释法分离: 方法： 1、利用选择培养基直接分离目的微生物 2. 富集培养 1、利用选择培养基直接分离目的微生物 抑制性选择培养基（selective medium）: 根据某种微生物的特殊营养要求或对某化学、物理因素的抗性而设计，只允许特定微生物生长，而同时抑制或阻止其它微生物生长的培养基。 提高普通光学显微镜分辨率的技术措施： 使用波长较短的可见光（450nm的蓝光）； 使用油浸物镜 增大反差（色差）的技术措施： 对微生物细胞或特殊结构染色 2、特殊的光学显微镜 相差显微镜 暗视野显微镜 荧光显微镜 相差显微镜的原理： 当光线通过透明的活细胞时，由于细胞内各部分结构密度的差异（或折射率的不同)，而使光波的相位发生变化，形成相位差，但人的眼睛分辨不出相位差异，相差显微镜就是根据光波干涉利用特殊的环状光阑和相差板将相位差转变为振幅差，从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强。 用途：活细胞运动情况和微细结构的观察 暗视野显微镜原理： 聚光系统加以改造，实现斜射照明，给样品照明的光不直接穿过物镜，而是由样品反射或折射后在进入物镜，所以样品是一个暗背景下显现亮的物象。 暗视野显微镜的分辨率很高 荧光显微镜的原理： 在紫外线的照射下，发荧光的物体会在黑暗的背景下表现为光亮的有色物体 二、电子显微镜的种类及原理 1、透射电镜（transmission electron microscope, TEM） 电磁波作“光源” 高速电子透射样品，电子束通过电磁场产生偏转、汇集或发散等复杂的螺旋式运动，聚集成像，用荧光屏或感光胶片做记录。 电磁波波长短，分辨率高：光学显微镜μm级，电镜nm级。 2、扫描电镜（scanning electron microscope, SEM） 电子束做电子探针在样品表面扫描时激发出二次电子，二次电子产生的多少与样品表面立体形貌有关。对二次电子处理，在荧光屏呈现放大样品表面立体图像。 3、扫描隧道显微镜 原理： 当金属探针可以接触到样品表面的电子云时，在探针和样品之间加零点几伏的电压将有隧道电流产生，该电流对针尖及样品间的距离非常敏感，保持探针扫描样品时的电压和高度恒定，通过记录电压或电流的变化了解样品的表面形貌。 4、原子力显微镜 用激光装置监测探针随样品表面的升降变化来获取样品表面形貌的信息 三、显微观察样品的制备 （1）光学显微镜制样 有活体直接观察和染色观察 悬滴法 活体观察 压滴法 菌丝包埋法 步骤： 固定（加热固定、化学剂固定） 染色 同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落 2、 显微镜个体观察技术 放大倍数 分辨率 反差 能辨别两点之间最小距离的能力 被观察物区别于背景的程度 一、显微技术： 用显微镜进行观察的技术 显微镜的自身特点有关 也取决于显微观察时对显微镜的正确使用 良好的标本制作和观察技术 评价显微镜性能的指标 二、光学显微镜的种类及原理 1. 普通光学显微镜 光学显微镜的一般配置 如何实现光学显微镜一般配置的最佳观察效果？ 目镜：10 ~ 15 ╳；物镜： 100 ╳；总放大倍数1000~1500 ╳； l 分辨率（最小可分辨距离）=