3. 基因工程制药教材编辑.ppt

4、溶解氧的影响 溶解氧是工程菌发酵培养过程中影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产物的生成影响很大。 外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的DO2值。 通常采用调节搅拌转速的方法，可以改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量。 ⒌ 诱导时机的影响 对于λPL启动子型的工程菌，使用cI阻遏蛋白的温度敏感型突变株（cIts857），在28～30 ℃下培养时，该突变体能合成有活性的阻遏蛋白阻遏PL启动子的转录。 当温度升高42℃时，该阻遏蛋白失活，使启动子启动转录，提高目的基因的表达效率。 一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。 ⒍ pH的影响 pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对pH进行适当的调节。 如采取两段培养工艺，培养前期重点是优化工程菌的生长条件，其最佳pH在6.8～7.4左右；培养后期重点是优化外源蛋白的表达条件,其最佳pH为6.0～6.5。 总之，工程菌发酵工艺的优化对异源蛋白的表达关系重大，必须建立最佳化工艺。获得最快周期、最高产量、最好质量、最低消耗、最大安全性、最周全的废物处理效果、最佳速度和最低失败率等。 α2a- IFN基因工程菌 发酵工艺的研究 批式培养方法：工程菌在进入对数期不久，即进入减速期，随后进入稳定期，此时菌体的浓度不高，菌体抑制物的积累也不多，还有充足的生长空间。如果有充足的营养物质和溶解氧，工程菌还会继续旺盛生长。 流加式培养方法：即在菌体进入减速期前，新的营养物质不断补充，使得工程菌始终处于最优环境，延长了稳定期，也就是延长了对数期。 流加培养基的组成和配比，不仅要满足工程菌生长代谢所需，还要有利于目的产物的表达。在补加营养时，速度不宜过快，否则溶氧量很快降低，会产生一些杂蛋白，因此在流加过程中要不断提高搅拌转速和通气量，来维持溶氧稳定。 工程菌生长和IFN活性关系：观察发现工程菌进入稳定期时菌体产量最高， IFN的活性也最高，因此，把握收获时机在干扰素生产中尤为重要。 参见： 1、王树君等，α2a型基因工程干扰素发酵工艺的研究，微生物学免疫学进展，2001年第29卷第2期. 2、王树君等，调解发酵温度提高干扰素的表达，中国生物制品学杂志，1993,6(1):17. 思考题 1、名词解释： 质粒分裂不稳定、质粒结构不稳定。 2、简述影响质粒不稳定的因素及解决方法。 3、简述温度对基因工程菌培养的影响。 4、简述溶解氧对基因工程菌培养的影响。 第八节 基因工程药物的分离纯化 建立分离纯化工艺的依据 分离纯化的基本过程 分离纯化的技术 选择分离纯化方法的依据 1、原料来源较丰富，但有效物质含量极低； 2、设备技术含量低，操作简单，生产周期长； 3、没有使用高分辨率的层析分离技术，存在胰岛素原等微量杂质，不能得到高纯度产品； 4、操作步骤多，活性物质损失多，收率较低。 猪胰岛素提取工艺的特点 一、建立分离纯化工艺的依据 1、含目的产物的起始物料的特点 菌种类型及其代谢特性 原材料和培养基的来源及其质量 生产工艺和条件 初始物料的物理、化学和生物学特性 2、物料中杂质的种类和性质 3、目的产物特性 4、产品质量的要求 发酵液 细胞分离 细胞破碎 固液分离 细胞碎片分离 包含体 变性 复性 浓缩 初步分离 高度纯化 制剂 产品 胞外产物 二、分离纯化的基本过程 一般不应超过4～5个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。 三、分离纯化的技术 1、细胞破碎与固液分离 （1）细胞分离： 细胞分离常用的是离心分离的方法 膜过滤法液逐步得到应用（微滤） （2）细胞破碎 工程菌高效表达的产物大部分在胞浆内； 细胞壁以肽聚糖为骨架，由乙酰葡萄胺和乙酰胞壁酸交替排列，形成有一定韧性的网状结构。 人胰岛素原表达法 生产技术的评价 在人胰岛素原表达工艺中，由于C肽的存在，胰岛素原能形成良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率也相应提高，折叠率高达80%以上。 虽然这条工艺路线并不比AB链分别表达法更为简捷，而且还要使用两种高纯度的酶制剂，但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷，使得每克最终产品的成本仅50美元。目前采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。 分泌型重组人胰岛素表达法 上述三种重组路线均采用胰岛素或胰岛素原编码序列与大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因拼接的方法，所产生的融合型重组蛋白表达率高、稳定性强，但不能分泌，只能以包涵体形式存在于胞质中。