盐角草磷酸乙醇胺n-甲基转移酶基因（sepeamt）启动子的克隆及瞬时表达.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（８）：６９～７３ 盐角草磷酸乙醇胺Ｎ甲基转移酶基因 （ＳｅＰＥＡＭＴ）启动子的克隆及瞬时表达  马赛箭　苏　乔 　吴　凇　安利佳 （大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系　大连　１１６０２４） 摘要　磷酸胆碱是合成磷脂酰胆碱和甘氨酸甜菜碱的重要前体，磷酸乙醇胺 Ｎ甲基转移酶 （ＰＥＡＭＴ）是磷酸胆碱合成的关键酶。根据已知的ＳｅＰＥＡＭＴｃＤＮＡ５′端序列设计２个基因特异的 反向引物（ＰＰ１，ＰＰ２），通过锚定ＰＣＲ获得了ＰＥＡＭＴ起始密码子上游１２４９ｂｐ的序列。ＲＬＭＲＡＣＥ 反应确定其转录起始位点Ａ位于起始密码子上游３０１ｂｐ处，由此获得了９４８ｂｐ的ＳｅＰＥＡＭＴ启动 子序列。ＰｌａｎｔＣＡＲＥ和ＰＬＡＣＥ在线启动子预测工具分析表明：该序列除了含有启动子的基本元 件ＴＡＴＡｂｏｘ和ＣＡＡＴｂｏｘ外，还含有一些胁迫诱导元件（如ＡＢＲＥ、ＨＳＥ、ＬＴＲ）和花粉特异的激活 元件ＡＧＡＡＡ。构建了ＳｅＰＥＡＭＴ启动子与报告基因ＧＵＳ融合的表达载体ｐＰｒｏ，并通过农杆菌介 导的叶盘法转化烟草，染色结果表明ＳｅＰＥＡＭＴ启动子可以有效地驱动ＧＵＳ基因的瞬时表达。 关键词　磷酸乙醇胺Ｎ甲基转移酶　锚定ＰＣＲ　启动子　序列分析　瞬时表达 中图分类号　Ｑ７８５ 　　胆碱是一种重要的代谢物质，它不仅是合成细胞 　　２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理的菠菜中ＰＥＡＭＴｍＲＮＡ的 ［５］ ［６］ 膜主要成分磷脂酰胆碱的底物，而且还可以在许多植 丰度比未经盐处理的高近 １０倍 。Ｃｈａｒｒｏｎ等 的 物的叶绿体中经过两步氧化生成甘氨酸甜菜碱。许多 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交结果也显示：小麦ＰＥＡＭＴ的转录水平在 生物在高盐、干旱、低温等逆境胁迫下可在体内积累甘 低温和ＮａＣｌ处理后会大幅提高，在ＡＢＡ和水分胁迫下 氨酸甜菜碱，从而起到维持细胞膨压、稳定酶和细胞膜 也会有一定量的提高。上述研究表明ＰＥＡＭＴ基因受 结构、清除自由基和保护光合系统复合物等作用［１］。 逆境胁迫诱导表达。另外，ＰＥＡＭＴ沉默的拟南芥植株 在植物中，催化胆碱生成甘氨酸甜菜碱的２个氧化酶 表现出一系列的形态学特征，包括叶片白化、早衰和对 分别是胆碱单氧化酶（ＣＭＯ）和甜菜碱醛脱氢酶 温度敏感的雄性不育，这说明ＰＥＡＭＴ不仅关系到甜菜 （ＢＡＤＨ）。ＣＭＯ和ＢＡＤＨ已通过基因工程手段转入到 ［７］ 碱的合成，同时也影响植物的正常生长和发育 。因 许多植物体中，但甘氨酸甜菜碱的积累并不显著，植物 此，克隆并分析其上游启动子序列以进一步研究 抗逆性的提高也不十分明显，这在很大程度上是因为 ＰＥＡＭＴ的表达调控是十分必要的。目前ＰＥＡＭＴ启动 ［２，３］ ［８］ 合成前体胆碱的供给不足 。胆碱是由磷酸乙醇胺 子序列只从玉米中克隆获得 ，且没有进一步的表达 在磷酸乙醇胺Ｎ甲基转移酶（ＰＥＡＭＴ）的作用下，经过 分析报道。 三步甲基化而生成的。据报道，在转入 ＣＭＯ和ＢＡＤＨ 　　盐角草 （Ｓａｌｉｃｏｒｎｉａｅｕｒｏｐａｅａ）是双子叶盐生植物， 的烟草中过表达ＰＥＡＭＴ可使磷酸胆碱和游离胆碱分 可在含盐３．５％以上的湿地生长，其体内主要的渗透调 别比对照提高５倍和５０倍，胆碱的增加使甘氨酸甜菜 ＋