实验三微生物显微技术-更多文档分类.docVIP

实验三 微生物显微技术 （一） 油镜的使用 一、实验目的 1.掌握油镜的使用原理、方法 2.熟悉细菌的基本形态 二、实验原理： 细菌的个体微小，以um计算，用肉眼难以观察。只有用显微镜将其放大到1000倍左右才能见到单个细菌，这就要使用油镜（10*100）。但随着镜头放大倍数的提高，透镜的凸度加大，物镜头的孔变小，通过的光线变少，视野变暗，物像模糊。为解决这一问题，人们除了升高集光、完全打开虹彩外，还利用香柏油与玻璃的折射率相近的这个物理条件来减少因折射造成的光线损失，增加视野亮度。 这节课我们主要学习掌握了油镜的使用和细菌形态的观察，用油镜观察细菌是微生物学实验的基本方法，也是这节课的重点，在以后的实验课中也要经常使用，同学们要掌握油镜的使用方法。 三、实验材料 1.油镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸 2.球杆菌混合标本片 四、实验步骤 1.将切片标本置于载物台上，使切片内的标本，对准镜台中央小孔，然后用压片夹固定切片。 2.将10×物镜移至中央（位于光轴上），旋动粗调节轮使物镜与载片相距1厘米左右。 3.将反光镜（自带光源的显微镜除外）对准光源，集光器调到适当亮度。 4.以左眼或右眼对准目镜，进行观察。旋动粗调节轮，使载物台渐渐上升，至标本的影象现出为止，拨动粗调限位器限位。 5.旋动细调节轮，使载物台上、下微微移动，直到显出清晰的影象。 6.用油镜前，先将集光器上升到顶，虹彩放大，使亮度达到最强度。 7.将需要详细观察的部分，移到视野中心，用压片夹固定，切勿移动。 8.将高倍物镜移开，滴加一滴香柏油于切片被检部位。 9.转换油镜头，使镜头与被检物间充满香柏油，然后转动细调节轮，直至有清晰的物象为止，此时切勿使用粗调节轮，以免压碎切片，损坏镜头。 10.用完油镜后，必须将镜头和切片上的香柏油用擦镜纸擦去，并用沾有乙醚——酒精液（7：3）的擦镜纸擦拭镜头及载片，以免污损镜头。（二）、细菌形态的观察 五、实验结果 1、镜下观察结果绘图 注意事项：显微镜的取放 （二） 细菌的简单染色法 一、实验目的 1 学习微生物涂片、染色的基本技术。 2 掌握细菌的简单染色法。 3 初步认识细菌的形态特征，巩固学习油镜的使用方法和无菌操作技术。 二、实验原理 细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。 当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。 染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。 三、实验材料 菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌24h营养琼脂斜面培养物。 染色剂：草酸铵结晶紫染液，蕃红染液。 仪器或其他用具：显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，玻片搁架、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)，擦镜纸，生理盐水或蒸馏水等。 四、实验步骤 涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检。 1.涂片 取两块洁净无油的载玻片，在无菌的条件下各滴一小滴生理盐水(或蒸溜水)于玻片中央，用接种环以无菌操作（演示），分别从枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌和大肠杆菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液(或液体培养物)涂片，可用接种环挑取2～3环直接涂于载玻片上。注意滴生理盐水（蒸馏水）和取菌时不宜过多且涂抹要均匀，不宜过厚。 2.干燥 室温自然干燥。也可以将涂面朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥。但切勿离火焰太近，因温度太高会破坏菌体形态。 3.固定 如用加热干燥，固定与干燥合为一步，方法同干燥。 演示涂片、干燥和热固定 4.染色 将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液1～2滴于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。吕氏碱性美蓝染色1～2min，石炭酸复红(或草酸铵结晶紫)染色约1min 。 5.水洗 倾去染液，用自来水从载玻片一端轻轻冲洗，直至从涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要水流直接冲洗涂面。水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。 6.干燥 甩去玻片上的水珠自然干燥、电吹风吹干或用吸水纸吸干均可以（注意勿擦去菌体）。 7.镜检 涂片干后镜