基于糖苷内切酶的N-糖链分析方法研究-分析化学专业论文.docxVIP

延边大学硕士学位论文摘要 延边大学硕士学位论文 摘要 糖链具有结构多样化的特点，对于糖链的研究具有现实意义。糖链携带复杂 的生物信息，与遗传、病理及人类生命活动有直接联系。糖基化过程与生理生化 过程密切相关，也与癌症等多发疾病的发生及病变有关，本文选用两种糖苷内切 酶Endo M和Endo M．N．175Q建立一种分析N．糖链的方法。Endo M．N．175Q作 为Endo M的突变体，在保留转糖基活性的同时几乎丧失了水解活性，因此在延 长酶反应时间的同时具有更高的转糖基效率。同时介绍了脱盐技术的发展情况， 重点说明了采用石墨碳柱进行纯化和富集的简便性、高效性，本文通过对石墨碳 柱富集寡糖洗脱方式的选择、酶切糖蛋白的酶的选择来建立一种分析糖蛋白中 N．糖链的方法，成功将此方法应用于复杂糖蛋白卵清蛋白的分析实验当中，成功 检NNA．种寡糖。根据报导，嗯唑啉无论是在化学糖基化法和化学酶糖基化法上 面是已知的非常好的糖基供体。在以嗯唑啉为底物时，使用Endo M．N．175Q进 行转糖基反应转移率可达到90％以上。以此为前提，为了进一步提高酶反应的转 移率，通过合成糖嗯唑啉探索提高酶反应转移率的方法。 本文通过四组实验对N．糖链进行分析研究。首先，唾液酸糖肽经链霉蛋白 酶E酶解，酶解产物通过石墨碳柱富集后进行Endo M—N．175Q酶反应，通过 LC．ESI．MS检测产物生成与否最终从三种不同的洗脱方式选择中性洗脱方式作 为富集寡糖的方法，将此方法应用于后续实验。其次，两组标准糖蛋白牛胰核糖 核酸酶B分别经链霉蛋白酶E和N一糖苷酶F酶解，酶解得到的寡糖通过石墨碳 柱富集后进行Endo M．N．175Q酶反应，经LC．ESI．MS检测。前者得到一种寡糖 M5N2，后者得到三种寡糖MsN2、MoN2、M8N2且含量高于前者，选用N．糖苷酶 F酶解糖蛋白。接着，将前文方法应用于复杂糖蛋白卵清蛋白中N．糖链的分析上， 用N．糖苷酶F酶解卵清蛋白，酶解产物通过石墨碳柱富集，进行Endo M．N．1 75Q 酶反应后经LC—ESI．MS检测得到M5N2等八种寡糖。最后，使用氮乙酰葡糖胺成 功合成糖嗯唑啉，将这一方法应用到唾液酸糖肽上，合成糖嗯唑啉后进行Endo M-N．175Q酶反应。反应结果与唾液酸糖肽直接进行Endo M酶反应的结果对比， 前者的积分峰面积是后者的14．2倍，以糖嗯唑啉为底物时进行Endo M-N．175Q 酶反应将显著提高酶反应转移率。 关键词：糖苷内切酶；石墨碳柱；N．糖苷酶F；N．糖链；糖嗯唑啉 万方数据 延边大学硕士学位论文Abstract 延边大学硕士学位论文 Abstract The sugar chain has the characteristics of diversification，The sugar chain carries complex biological information，which is directly related to heredity,pathology and human life activities．The glycosylation process is closely related to the physiological and biochemical process，and it is related to the occurrence and pathological changes of multiple diseases，such as cancer,which has practical significance for the research of the sugar chain．In this paper,two kinds of endoglycosidase Endo M and Endo M-N．175Q were used to analyze the enzyme reaction ofsugar chain．．Endo M-N-175Q as a mutant of Endo M，while retaining the activity of the conversion of sugar at the sanle time almost lost the hydrolysis activity,SO in the extension of the reaction time of the enzyme with a higher conversion efficiency．This paper introduces the development of desalination technology,focuses on t