斑马鱼组织石蜡切片质量的优化-江苏农业科学.pdfVIP

— ２６０— 江苏农业科学　２０１３年第４１卷第１１期 郑　伟，严继舟．斑马鱼组织石蜡切片质量的优化［Ｊ］．江苏农业科学，２０１３，４１（１１）：２６０－２６３． 斑马鱼组织石蜡切片质量的优化 郑　伟，严继舟 （上海海洋大学海洋科学研究院海洋生物系统和神经科学研究所／上海海洋大学水产与生命学院生物系，上海２０１３０６） 　　摘要：斑马鱼作为模式生物已经广泛运用于生物学各个研究领域。传统方法制作的斑马鱼组织石蜡切片经常出 现收缩、脆裂，主要原因是脱水和透明作用时间过长。为提高切片质量，本实验室摸索出了一套改善石蜡切片质量的 方法：以组织透明作为标志，摸索最短的脱水与透明时间，并适时采用脱水能力弱的脱水剂，提高了切片的质量，缩短 了试验时间。我们以斑马鱼的心脏、肠、脾脏为材料进行石蜡切片，结果表明，改进后的组织结构完整清晰，基本无脆 裂现象。本优化技术适合于小型动物的石蜡切片制作。 　　关键词：石蜡切片；斑马鱼；透明；脱水剂 　　中图分类号：Ｓ９１７．４　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０１３）１１－０２６０－０３ 　　斑马鱼以繁殖能力较强、胚胎透明、性成熟期较短、个体 出了一套优化石蜡切片的方案，通过优化试验条件，有效降低 短小、易养殖等特性，成为一种被广泛接受的模式生物。在药 了组织发脆和收缩的程度，提高了切片质量，同时也缩短了制 ［１］ ［２］ ［３］ ［４］ 物筛选 、遗传发育 、环境毒理 及神经科学 等方面有 片时间。 诸多的应用。在对斑马鱼的研究中，组织切片技术是运用最 １　材料与方法 多的技术手段。 组织切片技术是在组织胚胎学、生理病理学以及细胞生 １．１　材料 物学中，用来实时观察组织细胞变化的技术手段，该技术可以 成年斑马鱼的心脏、肠、脾脏。固定液为波恩氏液、４％多 克服无法观察组织内部变化的不足。组织切片是反映组织实 聚甲醛磷酸缓冲液（ＰＦＡ），均为新鲜配制。乙醇、二甲苯（宜 时状况最有效的手段，最接近体内状况的切片才能最真实地 兴市第二化学试剂厂生产，分析纯），叔丁醇（上海凌峰化学 反映出组织的变化。在组织切片中，运用最多的是石蜡切片 试剂有限公司生产，化学纯）。 和冰冻切片。冰冻切片工序简单，省时，各种抗原丢失少， １．２　方法 ＲＮＡ降解少，但不易得到清晰的组织结构，都会给前期观察 １．２．１　常规方法　将３种新鲜的组织分别按照如下步骤进 及后期的免疫组化、原位杂交的定位带来麻烦。石蜡切片则 行。分为２组：（１）波恩氏液（新配制）固定 １２ｈ，７０％乙醇 能得到精细清晰的组织细胞结构，对后期免疫组化和原位杂 （加有１滴浓氨水）洗涤至黄色褪去。脱水、透明程序：７０％ 交中信号定位是重要的，并且可以制成永久切片方便进行回 乙醇１ｈ，８０％乙醇１ｈ，９０％乙醇１ｈ，９５％乙醇１ｈ，无水乙醇 顾性研究，不足之处是耗时过长，抗原易失活，ＲＮＡ易降 １ｈ，无水乙醇－二甲苯等体积混合液０．５ｈ，二甲苯０．５ｈ（各 ［５］ 解 。在石蜡切片的制作过程中，固定就是让组织内的蛋白 液体用量均为５００ Ｌ）。（２）４％多聚甲醛缓冲液固定 １２ｈ， μ 质、糖类、脂肪等转变成不溶性物质，同时使附着在组织上的 流水冲洗４ｈ，脱水、透明程序同（１）。透明后于５７℃浸蜡， 微生物和细胞内的酶失去活性，进而防止组织的自溶，以使得 共２次，每次１ｈ。包埋，切６ ｍ，ＨＥ染色，处理温度为室温。 μ 组织与取材之前的结构和状态基本一致；脱水就是除去组织 １．２．２　改进方法　由于无法通过一些现象来证明组织内的 内部水分；透明就是