20140819-1 连接产物的转化(电转).docVIP

连接产物的转化英文字体改为 The times new roman 英文字体改为 The times new roman 感受态细胞的制备 准备： 1、GYT培养基(20 ml): 10% （V/V）Glycerol 2 ml终浓度10%，不是加10%glycerol 。注意区分 10% （V/V） 终浓度10%，不是加10%glycerol 。注意区分 0. 25%（m/V）Trytone 0.05 g 0. 25%（m/V） 0.125%（m/V）Yeast extract 0.025 g 0.125%（m/V） 2、LB培养基（200 ml，分装为两瓶，每瓶100 ml）： NaCL 2 g Trytone 2 g Yeast extract 1 g 用这个先不加NaCl，稀释5倍用于GYT制备。3、10% 的甘油 30 ml这个体积够吗？要算清楚 用这个先不加NaCl，稀释5倍用于GYT制备。 这个体积够吗？要算清楚 4、纯水 110 ml （全部放入高压灭菌锅灭菌）枪头管子等。 枪头管子等。 步骤： 1、从-80℃冰箱中取出感受态细胞Trans 5α放于冰上，使其缓慢融化。 2、将感受态细胞Trans 5α加入100 ml25 ml就可以了 LB培养基（Amp+）做了这么久，概念还不清楚吗？加抗生素干嘛？？？？？？？？？，过夜培养。 25 ml就可以了 做了这么久，概念还不清楚吗？加抗生素干嘛？？？？？？？？？ 3、接种5 mL25 ml全部倒入的过夜培养物加到100mL预热LB培养基（Amp+）同上。的锥形瓶中，于37℃摇动（300r/min）培养，每隔1 h测量一次 OD600 值，当OD600＞0.1后每隔15min测量一次 OD600 值，当OD600值达到0.35时就应收集细胞。 25 ml全部倒入 同上。 3．当OD600值达到0.4时，迅速将培养物置于冰浴中15一-30min．不时缓慢摇匀以保证内容物充分冷却。将离心管置于冰上预冷，为下一步做准备。 为获得最大效率的转化，在整个操作过程中细菌的温度不超过4℃是关健。 4．将细菌转移至两个冰冷的离心管（50 ml）注意无菌。中，4 ℃、2500 rpm、 离心15 min，以回收细胞。倒去培养液，每管50 ml冰冷的纯水重悬沉淀。 注意无菌。 5．4℃、2500rpm、离心20min, 以回收细胞。倒去培养液，用25 ml冰冷的10％甘油重悬沉淀。 6．4℃、2500rpm、离心20min, 以回收细胞。倒去培养液，用2ml冰冷的10％甘油重悬沉淀。并将两管菌合并为一管。 倾倒培养液时要小心，10％甘油中的细菌沉淀附着力降低。 7. 4℃、2500rpm、离心20min, 以回收细胞。小心倒掉上清液，再用连在真空器上的巴斯德吸管吸去管壁上的残留液体。加1ml冰冷的GYT培养液重悬沉淀。 这一步最好用轻柔播动完成，不要用吸管吹打或振荡。 8.100倍稀释上述悬液后测量OD600值。用冰冷的GYT培养液将其稀释至浓度为2×1010～3×1010个细胞／ml。(1.0 OD600=～2.5×108个细胞／ml)。 9．将悬液按100μl/份分装到冷却的无菌0.5 ml微量离心管中，封紧管口，贮存于一70℃备用。 电转化 冻存的感受态细胞Trans 5α，先于冰上溶解；分装感受态细胞，每个小管100 μL。 2．加入用于转化的连接产物DNA 4 μL，对照质粒加了4 μL凡是质粒用量都很少。连接产物和质粒是两个概念。；冰上静置5 min。 凡是质粒用量都很少。连接产物和质粒是两个概念。 3．转入电击杯(0.2 cm electrode)，冰上静置2 min； 插入电击仪(BTX细胞电穿孔仪ECM630)，电击（调节电击仪，使电容为25μF，电压2.5kV，电阻200Ω），电击； 4． 冰上静置2 min； 5．加入300 μL LB液体培养基（需用无抗生素LB肉汤这边知道不加抗生素，前面怎么写的。），放入摇床37℃、200 rpm、1 h 30 min； 这边知道不加抗生素，前面怎么写的。 6. 然后用加样枪将菌液加到LB平板上，用推棒涂平，等液体全部吸收了，倒置培养过夜(14~16 h)。 诱导表达 1、取15 ml的离心管编号，并依次加入1 ml的LB broth。在培养细菌的LB Plate用10 μl枪头挑取1个菌落加入离心管，放入恒温震荡器，37℃、150-200 rpm过夜培养。 2、过夜培养的菌：500 μl菌液+500 μl 30%甘油冻存于-20℃。 50 μl菌液+5 ml LB broth 37℃、150-200