Bcl-x选择性剪接微基因报告方法的建立.docVIP

Bcl-x选择性剪接微基因报告方法的建立 黄波基金项目：国家自然科学基金（No作者简介：黄波，男，1983年生，南昌大学2007级硕士研究生，Email：HYPERLINK mailto:。通讯作者：王小中，男，副教授，研究方向为白血病分子诊断，Email：HYPERLINK mailto:。，王小中1，王彩纹1，李静2，章海斌1 基金项目：国家自然科学基金（No 作者简介：黄波，男，1983年生，南昌大学2007级硕士研究生，Email：HYPERLINK mailto:。 通讯作者：王小中，男，副教授，研究方向为白血病分子诊断，Email：HYPERLINK mailto:。 （南昌大学：1第二附属医院检验科，2第一附属医院检验科，江西南昌330006；3 Department of Dermatology,The Feinberg school of Medicine,Northwestern University,Chicago,IL60611,USA） 【摘要】 目的：构建凋亡相关基因bcl-x微基因（minigene）及针对其重要顺式作用元件B2G,CRCE2的突变微基因，建立bcl-x微基因报告法并应用于bcl-x选择性剪接机制的研究。方法：首先用PCR从K562细胞基因组DNA中扩增出Bcl-x基因外显子2及内含子2的5′端部分序列片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(-)中，然后扩增出Bcl-x基因内含子2的3′端及外显子3部分序列，定向插入上一片段下游，构建成pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因。另外，以pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因为模板，利用反向PCR法构建突变微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x-B2G（M）, pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE2（M）。应用微基因及其突变微基因瞬时转染HL-60细胞，通过RT-PCR测定细胞中bcl-xL/bcl-xS mRNA水平的变化。结果：所克隆的bcl-x微基因及其突变微基因无一错误突变。在HL-60细胞中，bcl-x顺式作用元件B2G,CRCE2对bcl-xL/bcl-xS有一定影响。结论：成功构建人类凋亡相关基因Bcl-x的微基因及其突变微基因，顺式作用元件B2G缺失使bcl-xS几乎消失，CRCE2突变使bcl-xL/bcl-xS上升。 【关键词】微基因报告;微基因;突变微基因;bcl-xL/bcl-xS;选择性剪接 Establishment of the minigene method for reporting the alternative splicing of bcl-x [Abstract] AIM ：To construct the bcl-x minigene and its mutagenesis minigenes targeting its cis-elements called B2G、CRCE2, establishing the minigene report for future studing the alternative splicing of bcl-x. METHODS：At First, amplified the fragment (P1P2)including exon 2 and part of 5 ‘ sequence of intron 2 in bcl-x gene by PCR from human leukemia cell K562 genomic DNA ,Then,directionally inserted the fragment into the plasmid pcDNA3.1(-),we called it pc DNA3.1(-)-p1p2; and the second, we amplified the fragment(P3P4) including 3’ sequence of intron 2 and part of exon 3 in bcl-x gene, then directionally inserted the fragment into the downstream of fragment p1p2,we called it pc DNA3.1(-)-p1p2-p3p4,it is pcDNA3.1(-)-bcl-x minigene. On the other hand,we utilized pcDNA3.1(-)-bcl-x minigene as template to construct its mutagenesis gene called p