层析和膜技术在生物制药中的应用内容资料.pptVIP

金属螯合亲和层析的应用: 利用含汞树脂分离谷胱甘肽 谷胱甘肽中的半胱氨酸含有巯基，巯基化合物与汞具有很强的化学亲和作用，因此用含汞树脂提取含巯基化合物能取得很好的效果。 谷胱甘肽多从酵母中提取，也可从啤酒生产的废酵母中提取。酵母的提取液中除了含谷胱甘肽外，还含有其他含巯基的氨基酸和短肽，含汞树脂对这些物质也有一定的吸附。可通过调节酵母提取液的pH值，改变树脂对各种杂质成分的吸附力，以达到分离的目的。 有机染料亲和层析 基本原理：一些有机染料如蒽醌化合物和偶氮化合物具有类似于NAD+的结构，因此一些需要核苷酸类物质为辅酶的酶，对这些染料有一定的亲和力，如果这些染料作为配基共价偶联到纤维素或琼脂糖等多糖载体上，就能制得染料亲和层析柱。常用的有机染料有二羟偶氮复合物。 有机染料亲和层析已成功地分离纯化了多种酶，以及应用于白蛋白、脂蛋白和干扰素等的分离。 有机染料亲和层析应用： 苯丙氨酸脱氢酶的纯化 苯丙氨酸脱氢酶的纯化应用了有机染料亲和层析法。将一种模拟生物的染料配基（商品名：Procion Red HE-3B）,结合在Sepharose CL-4B上。Procion Red HE-3B与依靠NAD/NADH作辅酶的酶有特异性的结合，因而在分离这种类型的酶时，应用很广。 有机染料亲和层析应用： 苯丙氨酸脱氢酶的纯化 将含有苯丙氨酸脱氢酶的酶提取液上柱，亲和柱专一性地吸附苯丙氨酸脱氢酶。然后，用平衡缓冲液洗去杂蛋白，再用1mmol/L的 NADH（配于平衡缓冲液中）将酶洗脱下来。经过这种方法纯化的酶，纯度达到单一区带，达到了诊断用酶制剂的纯度要求。 苯丙氨酸脱氢酶可作为诊断试剂，用于测定和监测遗传性代谢疾病苯丙酮酸尿。作为诊断用酶制剂的市场很大。 四.膜分离技术 膜分离的概念：利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。 层析技术在 生物制药中的应用 离子交换层析技术 离子交换反应： 离子交换剂与交换离子间的作用是由静电引力而产生的，是一个可逆的反应过程，当这个反应达到动态平衡时，其平衡点随着pH、温度、溶剂的组成及交换剂本身性质的改变而变化。例如，向平衡体系中加入过量的X+离子，反应倾向于生成R-SO3-X+。 离子交换层析技术 由于待分离的溶质分子带有不同性质的电荷和不同电荷量，因而在作为固定相的离子交换剂和流动相的洗脱液之间发生可逆交换作用，并通过调节pH值、或改变同性离子的浓度等方法，使溶质分子移动的速度发生变化，从而达到分离的目的。 离子交换层析的应用 如庆大霉素，小诺霉素的提炼，应用了离子交换技术。 庆大霉素的提炼 酸化的目的在于将庆大霉素从菌丝体中释放出来，然后为了便于离子交换，将酸化液中和，再于中性溶液中投入732强酸性阳离子树脂。因为庆大霉素属于碱性抗生素，系有机碱，能与多种酸成盐，在水溶液中以离子状态G+存在，可以为阳离子树脂所吸附，对吸附了庆大霉素的732树脂进行洗涤，先用稀酸洗至无Ca2+、Mg2+，接着用无盐水洗至无Cl-，然后用稀氨洗去小组分杂质，最后用浓氨进行洗脱，洗脱液（解吸液）用711阴离子树脂进行脱色，然后经浓缩，转盐、活性炭脱色，喷雾干燥即得庆大霉素成品。 ? 离子交换层析的应用 粗卵蛋白的分级分离 卵蛋白中：主要有卵清蛋白54-57%（pI4.5)；蓝清蛋白12-15%（pI6.1)；卵粘蛋白3-4%(pI4.7)。 卵白过滤，用polybuffer74稀释，离心，上PBE94柱，以0.025mol/L咪唑-HCl (pH7.2)平衡，用1:10polybuffer74洗脱，分辨率良好。 二. 凝胶层析 凝胶层析，是指样品混合物通过一定孔经的凝胶固定相，由于流经体积的差异，使不同分子量的组分得以分离的一种分离技术。 因整个层析过程与过滤相似也称凝胶过滤。 又由于物质在分离过程中的阻滞减速现象，也称排阻层析。或称凝胶扩散层析。 凝胶的每个颗粒的细微结构如同一个筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，大的分子被排阻于凝胶颗粒之外，因而也称分子筛层析。 凝胶层析分离原理 分子筛理论最容易理解，当含有大小分子的混合物品流给凝胶层析柱时，各组分随洗脱液的流动而移动. 大分子进入不了颗粒内部，最先流出；中分子部分地进入颗粒，流出速度中等；小分子进入所有颗粒内部，移动速度慢，最后流出。整个样品接分子量大小顺序先后流出层析柱，从而达到分离。 凝胶层析分离原理 凝胶层析分离原理 当将含有三种不同分子量物质的混合样品用某种规格的凝胶柱进行分离，然后以洗脱体积为横坐标，各物质浓度为纵座标