广东省霍乱弧菌分子进化与变异研究-营养与食品卫生专业论文.docx

f㈣愀匙掣广东省霍乱弧菌分子进化与变异研究 f㈣愀匙掣 广东省霍乱弧菌分子进化与变异研究 博士研究生：李柏生 指导老师：张永慧 摘要 研究背景： 霍乱是由霍乱弧菌(Vibrio Cholerae，VC)引起的以急性水样便为主要特征 的肠道传染病。在已发现的200多个霍乱弧菌血清群中，只有01群和0139群 能够引起霍乱的暴发和流行。自1817年以来，霍乱已经引起了七次世界范围的 大流行，目前仍是我国一类防控的肠道传染病。广东省地处我国东南沿海地区， 与加尔各答、印度和孟加拉湾同处相同的纬度，是我国霍乱的流行高发地区。 1961年7月，广东省阳江县报告了我国建国以来首起埃尔托霍乱疫情以来，开 启了我国霍乱第七次大流行的序幕，至2013年止，我省霍乱累计发病近80000 例，死亡近2000人，严重影响和危害了人民健康，影响了生产、旅游、外贸、 交通运输，甚至社会安定。 霍乱肠毒素CT是霍乱弧菌最重要的致病因子，其编码基因为ctxAB，是目 前已知的致泄毒素中最强烈的毒素。携带ctxAB基因的霍乱弧菌称为产毒株，是 引起霍乱暴发流行的主要病原体，而不携带ctxAB基因的霍乱弧菌非产毒株对人 不致病或偶然有些菌株引起腹泻，一般不引起霍乱的暴发和流行。研究发现， 01群和0139群霍乱弧菌产毒株的基因组相对比较保守，第七次霍乱世界大流 行期间分离的01群埃尔托型霍乱弧菌产毒株的基因组仅存在细微的变化，这些 变化随时间的推移慢慢地累积，而01群和0139群非产毒株的基因组则表现出 明显的遗传多样性。这些研究基础将为我们进一步使用更高分辨率的分子分型 方法去研究霍乱弧菌产毒株的进化和变异特征提供基础。 细菌分型是推断菌株间关系的常用方法，可用于重新构建种系进化关系、 T 万方数据 中文摘要描述菌群结构，也可以用于传染病暴发的溯源分析。细菌分型早期主要依靠形 中文摘要 描述菌群结构，也可以用于传染病暴发的溯源分析。细菌分型早期主要依靠形 态学方法，如血清分型、噬菌体分型、毒素分型及抗生素耐药谱等。近年来， 基于DNA序列分析的分子分型成为主要的技术。其中，脉冲场凝胶电泳技术 (Pulsed field gel electrophoresis，PFGE)是当前细菌分子分型的主流技术，通过 限制性内切酶消化细菌基因组后产生的DNA指纹图谱进行暴发识别和溯源分 析。此外，多位点序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)和多位点可变 数目串联重复序列分析(Multilocus variable．number tandem repeat analysis， MLVA)等分子分型方法，通过互联网数据库大大简化和方便了不同实验室间的 数据交流与共享，有利于快速进行大范围的暴发调查和溯源分析。但是，这些 分型方法仅反映了病原菌基因组的局部遗传信息，分辨力有限，对于高度克隆 化的菌株，或进行大时间跨度的流行病学研究稍显不足。全基因组测序 (Whole．genome sequencing，WGS)分型，可在全基因组碱基序列的基础上进 行流行病学分析，全面反映了病原菌的遗传与变异特征，大大提高了菌株进化 和溯源分析的分辨力，有助于快速地确认并追踪到病原体。 上个世纪90年代开始，广东省在霍乱防治中逐渐建立了核糖体分型、脉冲 场凝胶电泳技术以及荧光聚合酶链反应等分子生物学监测技术，主要用于探索 在发生霍乱暴发疫情时，对病原体进行快速鉴定和溯源分析。目前，尚未有研 究对我省历年霍乱弧菌的病原学分子特征进行全面的梳理，尤其是在全基因组 的层面上对我省霍乱弧菌的基因多态性和遗传发生关系进行系统的分析。随着 新一代测序技术的成熟，WGS分型所需时间不断缩短，成本不断降低，全基因 组测序分型不仅能够全面反映基因组进化特点，对于研究病原菌的遗传与变异 以及对传染源的溯源分析均具有重要价值和明显优势。 本研究选取广东省1961．2013年50多年间从霍乱病例分离的381株01群 (稻叶型148株，小川型233株)和136株0139群霍乱弧菌代表性菌株进行血 清分型、毒力基因PCR检测、ctxB和tcpA基因扩增产物测序分型和PFGE分子 分型，以全面了解和掌握我省霍乱弧菌基本的菌型分布和分子特征，然后根据 PFGE指纹图谱、ctxB和tcpA基因分型结果，选择154株代表性的菌株进行全 TT 万方数据 博士学位论文基因组测序分型。将这154株代表菌株的全基因组序列与另外126株国内其它 博士学位论文 基因组测序分型。将这154株代表菌株的全基因组序列与另外126株国内其它 省份代表株和107株国际代表株的全基因组序列进行基于全基因组的单核苷酸 多态性鉴定(wg．SNPs)和构建最大似然树，以此深入分析我省霍乱弧菌基因变 异情况，并结合流行病学资料