桂花SSR引物的开发和SCoT分子标记体系的建立-遗传学专业论文.docxVIP

DEVELOPMENT OF SSR PRIMERS AND ESTABLISHMENT OF SCOT MOLECULAR MARKER SYSTEM IN OSMANTHUS FRAGRANS A Dissertation Submitted to the Graduate School of Henan University in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Science By Ma Yinfeng Supervisor: Prof. Shang Fude and vice-Prof. Yuan Wangjun May，2015 摘 要 桂花（Osmanthus fragrans Lour.），隶属于木犀科（Oleaceae）木犀属（Osmanthus）， 是我国传统十大名花之一。我国是木犀属植物的分布中心，拥有木犀属和桂花品种国际 登录权威，但桂花育种多年来一直进展缓慢。杂交育种是培育优良品种的有效途径之一， 然而，桂花从种子萌发到开花需要 6-8 年的时间，育种周期很长。利用合适的分子标记 构建高密度的分子遗传图谱可以鉴定出与表型变异密切相关的标记位点。这些标记可以 用于早期育种时的早期选择，有效提高桂花育种的效率，节约成本。SSR（Simple Sequence Repeat，简单重复序列）标记是基于 DNA 长度多态性的分子标记技术，该技术检测手 段简易且特异性强，成为分析群体遗传结构及构建分子遗传图谱的重要工具。SCoT（start codon targeted polymorphism，目标起始密码子多态性）是以植物基因组中 ATG 位点侧 端的保守性来设计引物（单引物），产生与目标基因相关联的多态性标记，其操作简便、 可靠性高，目前已成功运用于水稻等多种植物中，是传统的分子标记 AFLP、RAPD、 SRAP 和 ISSR 等的重要技术补充。 本研究拟通过高通量测序（Roche 454 GS FLX+）开发了足够多的桂花 SSR 引物， 同时构建了其 SCoT 分子标记的扩增体系，为桂花的分子遗传图谱构建提供技术支持。 其结果如下： 1.采用高通量测序法开发了桂花的 SSR 引物。共获得 89633 条序列片段，利用 MISA1.0 搜索具有重复单元的序列，primer5.0 进行引物设计，最终获得 3006 条 SSR 引 物，已向 GenBank 提交 1471 条。 2.目前随机筛选了其中的 100 对，80 对不能检测到条带或不具有多态性，20 对具有 多态性，且扩增条带清晰。因此有大量的 SSR 引物可用于构建桂花的饱和分子遗传图谱。 3.以2×Es TaqMasterMix预混液为基本体系，针对影响桂花SCoT扩增反应的退火温 度、模板用量、引物浓度等因素进行优化，建立了适于桂花SCoT分子标记的体系。从 36对SCoT引物中筛选出了可用于桂花的12条SCoT引物。12 μL反应体系含有30 ng模板 DNA，引物浓度为0.4 μmol.L-1。不同的引物退火温度分别为48℃、49.9℃、54.3℃或56℃。 4.运用该体系对12个桂花品种进行扩增，共得到了244条带，其中多态性条带占238 条，多态性比率高达97.47%，每对引物平均扩增出的多态性条带数是19.83条。对SCoT 扩增的结果采用UPGMA法进行聚类分析，表明桂花各品种之间的亲缘关系与花色不完 I 全相关，这与其它分子标记的结果相类似。实验结果表明，本研究建立的SCoT分子标 记体系结果稳定，可用于桂花分子遗传图谱的构建。 关键词：桂花，SCoT 分子标记，引物开发，SSR 分子标记 II III III IV IV ABSTRACT Osmanthus fragrans Lour., Oleaceae, Osmanthus is one of Chinas top ten traditional flowers. China is the distribution center of Osmanthus species, and has been endowed with international registration authority of Osmanthus plants and O. fragrans cultivars. Cross breeding is an effective method for creating new cultivars. O.fragrans individuals unfortunately take between 6 and 8 years to progress