mir-19b致胚胎心脏畸形的机制？.pptVIP

结果发现，孕中期左心发育不良胚胎心肌组织中Wnt1、β-catenin 基因与蛋白表达均显著下调，GSK3β基因与蛋白的表达则显著上调，提示左心发育不良胚胎心肌组织中存在Wnt 信号通路明显受抑的现象。其中，GSK3β、β-catenin 在基因、蛋白表达水平的变化幅度基本一致，Wnt1 基因、蛋白表达水平的变化幅度则不一致，左心发育不良胚胎心肌组织中Wnt1 蛋白表达下调的程度更高（见工作基础中图11），符合我们的预期，此与miRNA与靶基因特异性碱基互补配对后主要抑制其蛋白翻译、不抑制其转录等特点相一致[16]。该研究结果提示，Wnt1 可能不仅仅是miR-19b 调控的下游靶基因，而且miR-19b 在致胚胎心脏发育畸形中的作用极可能通过影响Wnt 信号途径的机制来实现。鉴于上述预研结果尚不充分，还不能直接获得miR-19b 通过影响Wnt 信号途径导致胚胎心脏发育畸形的结论，如：miR-19b 在致胚胎心脏发育畸形中的作用尚应获得miR-19b 特异敲除实验结果的支持、通过荧光素酶报告基因的实验来提供miR-19b 调控Wnt1 的直接证据[17]等，因此以前期研究为基础、进一步较系统地论证其机制尤为必要。 鉴于上述分析和我们已获得的研究结论，本研究拟以早期心脏发生中发挥重要作用的Wnt 信号通路为切入点，深入探讨miRNA-19b 致胚胎心脏发育畸形的机制。首先通过分析miRNA-19b 过表达或表达沉默时斑马鱼心脏发育情况（如心脏发育异常个体的百分比、心率）及对Wnt 信号通路的影响（原位杂交观察斑马鱼心肌中Wnt信号通路中相关基因Wnt1、GSK3β、β-catenin 的表达水平），获得miRNA-19b 影响Wnt 信号通路致胚胎心脏发育畸形较充分的实验证据；继而分别构建Wnt1 与miRNA-19b 的过表达或沉默表达载体，通过双载体转染（“miRNA-19b 沉默+ Wnt1 过表达”或“miRNA-19b 过表达+Wnt1 沉默”） 观察斑马鱼心脏发育情况，论证miRNA-19b影响Wnt 信号通路致胚胎心脏发育畸形的机制；进一步构建miRNA-19b 表达载体和含野生型或突变体的Wnt1 启动子的荧光素酶报告基因质粒，分别共转染入中胚层来源的P19 细胞，通过检测荧光素酶的活性及Wnt 信号通路中关键分子Wnt1、GSK3β、β-catenin 的基因和蛋白表达水平的变化，揭示miRNA-19b 对Wnt1 的调控机制。由于miRNA-19b 致胚胎心脏畸形及其机制研究目前未见报道，本研究具有源头创新性。研究若成功，将为阐明miRNA-19b 致胚胎心脏畸形的机制提供新的线索，为先天性心脏病在妊娠期的早期防治提供新的理论依据。 鉴于上述分析和我们已获得的研究结论，本研究拟以早期心脏发生中发挥重要作用的Wnt 信号通路为切入点，深入探讨miR-19b 致胚胎心脏发育畸形的分子机制。首先通过观察miR-19b 过表达、表达沉默时斑马鱼心脏的发育情况（记录心脏发育畸形率、心率，心脏连续切片观察心脏超微形态）和Wnt 信号通路的变化（原位杂交检测斑马鱼心脏中Wnt1、GSK3β、β-catenin 的表达变化），从正反两方面获得miR-19b 影响Wnt 信号通路致胚胎心脏发育畸形较充分的实验证据；进一步以Wnt 信号通路为切入点， 联合应用吗啡啉修饰的反义寡核苷酸（morpholino-modified antisense oligonucleotides，MO）技术和过表达技术，评判miR-19b 致胚胎心脏发育畸形的Wnt信号机制；通过构建miR-19b 表达载体和含野生型或突变体的Wnt1 3′ UTR 荧光素酶报告基因质粒，分别或共转染中胚层来源的P19 细胞（在1%DMSO 中可定向分化为具有搏动能力的心肌细胞，已作为心肌细胞模型广泛应用于心肌细胞发育的分子机制研究中）[18]，检测荧光素酶活性的变化及Wnt 信号通路中关键分子Wnt1、GSK3β、β-catenin 基因和蛋白表达水平的变化，来论证miR-19b 对Wnt1 的调控作用，以揭示miR-19b 对Wnt 信号通路的分子调控作用。 * * 国家自然科学基金 标书写作分析 miR-19b致胚胎心脏畸形的机制研究 思路与背景介绍 心脏发育很重要 从胎儿畸形心脏-正常心脏中寻找研究线索----差异miRNA miRNA19b差异明显、生物信息学分析发现其在物种间功能保守 做实验发现： miRNA19b过表达可以导致斑马鱼心脏畸形（功能） 读心脏发育文献：影响WNT、BMP、TGFbeta是怀疑的可能机制（机制） 生物信息学分析发现： miRNA19b下游