HIS-TAG蛋白质的表达纯化.docxVIP

蛋白质的表达、分离、纯化实验的实验原理和操作步骤 携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在 37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。 一、试剂准备? 1. ?LB液体培养基：Trytone 10 g， yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸馏水配至1000 mL。? 2. ?氨苄青霉素：100 mg/mL。? 3. ?上样缓冲液：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8M Urea，10 mM ?2-ME，pH8.0。? 4. ?Washing Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8 M Urea，pH6.3。? 5. ? Elution Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8M Urea， 500 mM Imidazole， pH8.0。? 6. ? IPTG：100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 ? 二、获得目的基因 ? 1. ?通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 ? 2. ?通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 ? 三、构建重组表达载体 ? 1. ?载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 ? 2. ?PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。 ? 四、获得含重组表达质粒的表达菌种 ? 1. ?将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 ? 2. ?测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 ? 3. ?以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。 ? 五、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导? 1. ? 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5 mL LB液体培养基中（含100 ug/mL 氨苄青霉素），37℃震荡培养过夜。? 2. ?按1∶50或1：100的比例稀释过夜菌，一般转接1 mL过夜培养物于100 mL（含100 ug/mL 氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600?= 0.6 - 0.8（最好0.6，大约需3 h）。取10 ul 样品用于SDS分析。? 3. ? 对照组不加诱导剂，实验组加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l，37℃继续培养1-3h。? 4. ?12 000 rpm 离心10 min，弃上清，菌体沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。? 六、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离、纯化? 1. ?NTA层析柱的准备：在层析柱中加入1 mL NTA介质，并分别用8 mL 去离子水，8 mL上样缓冲液洗涤。? 2. ?重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融菌体沉淀，加入5 mL上样缓冲液， 用吸管抽吸重悬，超声波破裂菌体，用振荡器等轻柔的混匀样品60 min，4℃ 12000 rpm 离心 30 min，将上清吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。取10 ul 上清样品用于SDS分析。? 3. ?上清样品以10-15 mL/h 流速上Ni2+-NTA柱，收集流出液，取10 ul样品用于SDS分析。? 4. ?洗脱杂蛋白：用Washing Buffer以10-15 mL/h流速洗柱，直至OD280?= 0.01分步收集洗脱液，约3-4 h，取10 ul洗脱开始时的样品用于SDS分析。? 5. ?洗脱目标蛋白：用Elution Buffer洗柱，收集每1 mL 级分，分别取10 ul样品用于SDS分析。