水稻总蛋白抽提-Bio-protocol.PDF

/e1010120 DOI:10.21769/BioProtoc.1010120 水稻总蛋白抽提 Total Protein Extraction from Rice 陈香嵩，程赛凤，周少立，赵毓* 作物遗传改良国家重点实验室，华中农业大学，武汉 *通讯作者邮箱：zhaoyu@ 引用格式：陈香嵩，程赛凤，周少立，赵毓. (2018). 水稻总蛋白抽提. Bio-101 e1010120. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010120. How to cite: Chen, X. S., Cheng, S. F., Zhou, S. L. and Zhao, Y. (2018). Total protein extraction from rice. Bio- 101 e1010120. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010120. (in Chinese) 简要原理：以去污剂和盐离子破坏膜结构，释放出总蛋白。本方法操作简单，且蛋白 抽提彻底。 关键词：总蛋白，水稻，粗提 材料与试剂 1. 1.5 ml 离心管 2. 各种型号枪头 (20 μl, 200 μl, 1 ml) 3. 液氮 4. 1 M Tris-HCl (固体Tris 碱配制，浓盐酸调节pH) 5. SDS 6. 甘油 7. β-巯基乙醇 8. 溴酚蓝 9. 5 M NaCl (固体配制，国药集团) 10. Triton X-100 (上海生工分装进口试剂) 11. Protease Inhibitor (Roche, catalog number: 11836153001) 12. 总蛋白抽提缓冲液 (见溶液配方) 13. 4x Laemmli buffer (见溶液配方) Copyright © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 1 /e1010120 DOI:10.21769/BioProtoc.1010120 仪器设备 1. 移液枪 (20 μl, 200 μl, 1 ml) 2. 天平 3. 高速冷冻离心机 4. 研钵 实验步骤 1. 取200 μl 总蛋白抽提缓冲液加入到1.5 ml 离心管中，放在冰上待用。 2. 液氮研磨水稻叶片，取大约0.1 g 粉末，加入到200 μl 缓冲液中，充分混匀。 3. 12,000 rpm 冷冻离心10 分钟。 4. 取上清，以3:1 加入4x Laemmli buffer，混匀后95 度以上变性10 分钟,冰上冷却 5 分钟。 5. 室温12,000 rpm 5 分钟，取上清进行 SDS检测。 注：本方法操作简单且蛋白抽提彻底，但是电泳过程中杂质较多，大分子量蛋白条 带不清晰。 6. 本实验方法可简化为： 将用液氮磨好的粉末以0.1 g/200 μl 的比例直接加入到1x Laemmli buffer 中，混匀 后 95 度以上变性 10 分钟，离心取上清即为变性后的总蛋白，可直接用于 SDS- PAGE 检测。 溶液配方 1. 4x Laemmli buffer 配方 80 ml 用量 250 mM Tris-HCl (pH 6.8) 20 ml 1M 8% SDS 6.4 g 40%甘油 32 ml 4% β-巯基乙醇 3.2 ml 0.01%溴酚蓝 0.008 g 注：溴酚蓝可不必称量，边加边观察颜色变化，适量即可，过多会导致颜色偏红。 Copyright © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 2 /e1010120 DOI:10.21769/BioProtoc.1010120 2. 总蛋白