高效液相色谱法测定铁皮石斛中的甘露糖1材料与方法-东西分析.PDF

高效液相色谱法测定铁皮石斛中的甘露糖 铁皮石斛为兰科植物铁皮石斛 Dendrobiumofficinale Kimuraet Migo的干燥茎 ， 具有益胃生津 ，滋阴清热之功效 ，因其特殊的生存环境和卓著的滋补功效名列 “中华九大仙 草”之首。由于石斛药材在化学成分和结构组织上具有一定相似性 ，使鉴定和质量评价工作 较困难。目前常用的方法之一是高效液相色谱法 ，《中国药典》2015第一部规定 ：供试品 色谱中 ，甘露糖与葡萄糖的峰面积比应为 （2.4~8.0）；所采用高效液相色谱的理论塔板数 按甘露糖峰计算应不低于 4000；按干燥品计算 ，含甘露糖 （CHO）应为(13.0~38.0)%。 本文采用北京东西分析仪器有限公司的LC-5510型高效液相色谱仪 ，按照《中国药典》2015 第一部所提供的方法对铁皮石斛中的甘露糖含量进行检测。 1 材料与方法 1.1 主要材料与试剂 甘露糖对照品 ：中国药品生物检定所 ； 葡萄糖对照品 ：中国药品生物检定所 ； 盐酸氨基葡萄糖 ：贵州迪大科技有限责任公司 ； PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮 ）（分析纯 ）； 甲醇 （优级纯 ）； 氢氧化钠 （分析纯 ）； 盐酸 （优级纯 ）； 三氯甲烷 （分析纯 ）； 乙醇 （优级纯 ）； 乙腈 （色谱纯 ）； 乙酸铵 （优级纯 ） 1.2 主要仪器与设备 北京东西分析仪器有限公司 LC-5510高效液相色谱仪 （配有紫外检测器 ）及在线脱气机 离心机、索氏提取器、水浴锅、超声清洗器等。 1.3 试验条件 1.3.1 色谱条件 色谱柱 ：EWAI C18-2 柱 缓冲液 ：0.02mol/L乙酸铵溶液 - 1- 流动相 ：乙腈 ：缓冲液 20 ：80 流速 ：1.0ml/min；进样量 20μL；柱温 ：室温 ；检测波长 ：250nm 1.3.2 校正因子计算 取盐酸氨基葡萄糖适量 ，配置成 1ml含 12mg的溶液 ，作为内标溶液。另取甘露糖对 照品置于容量瓶中 ，加入内标溶液,加水适量使溶解并稀释至刻度 ，摇匀 ，吸取 400μl，加 入 PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮 ）甲醇溶液与氢氧化钠溶液各 400μl，混匀 ，加热水 浴反应。再加盐酸溶液混匀 ，用三氯甲烷洗涤 ，弃去三氯甲烷液 ，水层离心后 ，取上清液 10μl,注入液相色谱仪 ，测定 ，计算校正因子。 1.3.3 样品制备与测定 取本品粉末 0.1219g,置索氏提取器中 ，乙醇加热回流提取 ，弃去乙醇液 ，药淹挥干乙 醇 ，滤纸筒拆开置于烧杯中 ，加水再加入内标溶液 ，搅拌下煎煮小时 ，室温加水、混匀 ，离 心 ，吸取上清液适量置顶空瓶中 ，加盐酸溶液、封口 ，混匀、水解、放冷 ，用氢氧化钠溶液 调节 pH值至中性 ，取上清液注入液相色谱仪 ，测定 ，即得。 2 结果与分析 2.1色谱图及甘露糖含量 图 1 甘露糖对照品谱图 对谱图进行积分 ，输入内标物含量及甘露糖含量 ，由 LC5510操作软件直接获取校正 - 2 - 因子见下表: 组分名 保留时间 峰面积 峰高 浓度 校正因子 （mg/ml） 甘露糖对照品 14.34 932946 48310 0.098 0.5944 PMP 15.84 257741 5741 内标物 19.14 1118490 41883 0.12 2 图 铁皮石斛样品谱图 对谱图进行积分 ，输入内标物含量及甘露糖含量 ，由 LC5510操作软件直接获取甘露 糖浓度见下表: 组分名 保留时间 峰面积 峰高 理论塔板数 浓