丙酮醛对胚干细胞凋亡及分化之影响.DOC

丙酮醛對胚幹細胞凋亡及分化之影響 Effects of Methylglyoxal (MG) on Embryonic Stem Cell Death and Differentiation 研究生：陳妙德 Chen, Miao-Der 指導教授：許岩得 Hsuuw, Yen-Der 【摘要】 丙酮醛 (Methylglyoxal, MG) 在生活環境中廣泛存在於環境及各類食物中，為體內醣類代謝或脂質過氧化途徑之中間產物；高濃度的MG其具有細胞毒性物質亦會造成致癌及基因突變。有研究指出高濃度MG將會對囊胚發育有明顯抑制作用，尤其抑制囊胚之內細胞團 (inner cell mass, ICM) 之生長而影響囊胚後續著床發育。為進一步了解MG對胚幹 (Embryonic stem, ES) 細胞的影響機制，故本研究旨在探討MG對胚幹細胞生長、凋亡及分化之影響。試驗一：探討MG對胚幹細胞生長的影響。將胚幹細胞以0.1、0.2、0.3、0.5、1mM MG分別處理24或48小時，利用粒線體酵素活性檢測 (MTT assay)細胞生長，並以雙重染色法 (Dual staining) 檢測細胞核之片斷化。結果顯示MG對胚幹細胞的增殖率有顯著的抑制 (P 0.05)，且 MG對胚幹細胞具有時間及劑量依賴性的生長抑制作用。雙重染色結果指出MG濃度的增加有顯著地提高細胞壞死與細胞凋亡的比率 (P 0.05)。由此可知MG對胚幹細胞生長的抑制作用與MG誘導細胞毒性作用有關。試驗二：探討MG誘導胚幹細胞凋亡之影響。利用DNA斷端檢測法 (in situ cell death detection kit, TUNEL) 檢測細胞中DNA損傷現象，並以西方墨點法 (western blots)分析細胞週期表現蛋白質（Cyclin D1, Cyclin E）及細胞凋亡特定蛋白質 (PARP, p27, p21) 的表現。結果指出MG會顯著增加誘導胚幹細胞DNA的片斷化 (P 0.05)，此MG誘導細胞凋亡作用與MG誘發胚幹細胞內細胞凋亡蛋白質PARP活化有關。細胞週期相關蛋白質分析結果顯示，MG對胚幹細胞的細胞毒性與細胞週期抑制有關。故MG抑制胚幹細胞的生長可能藉由MG誘發細胞週期停滯導致細胞死亡。試驗三：探討MG 對胚幹細胞分化的影響。以定量Real-time PCR檢測胚幹細胞之特定未分化 (Rex-1) 及分化基因 (Hnf-4及 pax6)的表現差異。結果指出當0.1 mM MG於24小時作用時間後，能增加胚幹細胞的外胚層分化。然而在0.1mM MG的濃度作用72小時，能顯著增加內胚層特定基因Hnf-4的表現量，但呈現抑制外胚層分化的現象。綜合上述研究結果，MG對胚幹細胞的生長具有抑制作用；此MG誘導胚幹細胞死亡機制與MG活化細胞凋亡蛋白質PARP及細胞週期抑制蛋白質p21及p27有關；而MG除了誘導胚幹細胞死亡之外，在長時間的作用之下MG亦會誘導胚幹細胞之分化。 關鍵詞：丙酮醛、胚幹細胞、細胞分化、細胞凋亡 【Abstract】 Methylglyoxal (MG) is an endogenous metabolite derived from the glycolytic pathway or the lipid oxidation. Major sources of exogenous MG have been found in the many kinds of food. However the high concentration of MG can cause genetic mutation and cancer. Recent studies have showed that MG reduces the mouse blastocyst development, and MG exerts a selective inhibition on inner cell mass (responsible for fetal growth). To learn about the effect of MG on embryo development, we used ICM-derived embryonic stem cells as a substitute of ICM function. The purpose of this study was to investigate the effects of MG on ES cell growth, cell apoptosis, and cell differentiation. ES cells were cultured with indicated