免疫学检测技术及在食品中的应用.ppt

酶 在ELISA中，可以采用的有HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。 HRP（辣根过氧化物酶）是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分子量为44000，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。 * PPT课件 底物 HRP的底物 DH2+ H2O2 D+ 2H2O DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。 DH2如：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)等。 * PPT课件 OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高 TMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm。 * PPT课件 1.5ELISA 影响因素 固相载体：ELISA 中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板。 抗原：可溶性、优质、稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。 试验样品：血清、血浆或其他体液，均可作为 ELISA 的试验样品。 结合物：酶结合物要求稳定，具有很高的酶活性，抗原或抗体的特异性，产量高及成本低。 底物：各种酶都有对底物的特异性，不同种类的酶要求有不同的底物。 作用时间：加底物后终止时间？ 结果判断:ELISA 的试验结果可用肉眼观察颜色反应的深浅作出判断，也可用分光光度计作精确测定。 试验的重复性（精确度） ：通常用变异系数来表示。 * PPT课件 思考：如何研发商品化的ELISA试剂盒？ 需要什么原料，得到哪些组分，摸清哪些条件，才能够进行组装？ * PPT课件 2免疫胶体金技术 （胶体金试纸条检测技术、胶体金层析） * PPT课件 大肠杆菌O157:H7快速检测 试纸（胶体金） * PPT课件 2.1 简 介 胶体金试纸条诊断是采用胶体金免疫层析技术研制而成，该技术是90年代初在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术，最先用于人绒毛膜促性腺激素（HCG）的测定和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）等检测。 * PPT课件 胶体金（Colloidal gold）是氯金酸（HAuCl4）的水溶胶，氯金酸在还原剂的作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态。故称胶体金 * PPT课件 用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒 质量好的胶体金：溶液呈红色，胶体金颗粒为球形，大小均一，无棱角。 质量差的胶体金：溶液呈紫色，大小不一，形状各异。 胶体金的质量判定标准 * PPT课件 胶体金标记的原理： 胶体金在碱性条件下带负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团静电吸引而形成牢固结合。 胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。 标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中 * PPT课件 2.2胶体金试纸条诊断技术的原理 以硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细血管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，通过抗原抗体结合，并利用胶体金呈现颜色（红色）反应，检测抗原/抗体。 * PPT课件 检测线 质控线 吸收垫 样品垫 硝酸纤维素膜 胶体金垫 背衬 （底板） 胶体金试纸条示意图 * PPT课件 2.3 分类 间接法----测抗体 双抗夹心法----测大分子抗原 ----食品中沙门氏菌的检测 竞争法----测小分子抗原 ----食品中瘦肉精、黄曲霉毒素的检测 * PPT课件 沙门氏菌单克隆抗体 可能含有沙门氏菌的样品 （1）双抗夹心法检测抗原——测大分子抗原 沙门氏菌多克隆抗体 抗抗体 * PPT课件 PPT课件 PPT课件 利用免疫学技术可以检测细菌、真菌、病毒、寄生虫、各种毒素、蛋白 还可检测激素、药物残留、抗生素及其他生理活性物质 * PPT课件 1酶免疫技术——ELISA检测技术 * PPT课件 ELISA 全称：酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immuno sorbent assay） * PPT课件 将抗原抗体的特异性与酶反应的敏感性相结合，使得食品在未经分离提取的前提下，即能进行定性或定量检测 广泛用于细菌、真菌、病毒、寄生虫、各种毒素等大分子蛋白，以及激素、农兽药残留、抗生素能小分子物质的检测 * PPT课件 可检测标本类型广泛 体液：血清、血浆、胸腹水、灌洗液、脑脊液 分泌物：唾液 排泄物：尿液、粪便等 细胞培养上清 组织匀浆 * PPT课件 1.1 ELISA 的发展历程 免疫酶标记技术是继免疫荧光抗体技术和放射免疫分析之后发展起来的一大新型的血清学技术。 1966年