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重组大肠杆菌产PAL的发酵优化 导 师: 朱龙宝 答辩人: 张瑞伟 学 号：3082106220 班 级：生工2082班 1.研究课题目的与意义 * 3 目 录 1 研究课题目的与意义 2 实验简要流程 3 实验结果 4 讨论与展望 5 致谢 药用 需求 红景 天苷资源 现状 1961年,Koukol等首次从绿色植物中发现苯丙氨酸 解氨酶( phenylalanine ammonia- lyase,PAL,EC4. 3. 1. 5)PAL, 并进行了分离纯化, 随着PAL研究的迅速展开, 在真细菌和藻类中也发现该酶的存在。研究表明PAL有重要的药用价值。 背景 太“重”啦！ 药用 需求 PAL资源 现状 太“重”啦！ 传统方法获得PAL量很少，工业上通过携带PAL基因重组大肠杆菌发酵。因此，对其发酵优化调高产量有着重要意义。 苯丙烷类途径生成反式肉桂酸、香豆酸、 阿魏酸、芥子酸等中间产物，进一步转化 为香豆素、绿原酸, 进一步转化为木质素、黄 酮、异黄酮、生物碱、苯甲酸酯糖苷等次生代谢产 物。这些产物在植物细胞分化、木质化、植物色素形 成、根瘤形成、抗逆境、抗虫性和抗病中起着重要的 作用。 PAL一方面合成D-苯丙氨酸( D-Phenyla lanine, D-另一方面用苯丙氨酸脱氨酶来治疗经典型苯丙酮尿 症( 简称PKU)。 意义 目的 2.实验的简要流程 菌体生长曲线测定 单因素实验 响应面实验 验证试验 结果分析 结论 反式肉桂酸标准曲线测定 3.1 菌体生长曲线的测定 通过IPTG试剂后在20-24℃下诱导10-14h，每隔2h对培养基取样，稀释10倍后用可见光分光度计测量其A620nm 吸光度。 3.2 标准曲线测定 用25 mmol/LTris-HCl( pH 8.8)分别配置1、2、3、4、5、6 mg/L的反式肉桂酸, 用25 mmol/LTris-HCl( pH8.8)做参比,测定其在A290nm的吸光值, 得到反式肉桂酸标准曲线。 3.实验结果 图1 菌体生长曲线的测定 图2 反式肉桂酸标准曲线及相关系数R2 单因素实验 3.3 培养基初始pH值对PAL酶活性的影响 由图3-3可知，当初始pH值在7-7.5之间时，重组PAL的酶活力较高，低于或高于这个范围酶活都受到抑制。表明过高的pH值不但抑制了重组菌的生长，同时对重组菌产酶也会有抑制作用。而过低的pH值可能会使菌体量过低，菌体过早衰亡，导致产酶减少，酶活降低。 图3-3 初始pH值对重组PAL酶活性的影响 单因素实验 3.4 发酵时间对PAL酶活性的影响 图3-4 发酵时间对PAL酶活性的影响 由图3-4可知，发酵时间12h时，重组PAL活力最高， 超过12h，活力开始下降。 图3-5 装液量对PAL酶活性的影响 3.5 装液量对PAL酶活性的影响 单因素实验 由图3-5可知，当装液量为150ml时，重组PAL活力最大。随着装液量超过150ml后，重组PAL活力反而下降。装液量过大，溶液中溶解氧不足，导致菌体生长受阻，产酶降低。装液量过低，培养基中营养物质消耗过快，菌体生长也会受阻，产酶受到影响。 单因素实验 由图3-6可知，在接种量时，重组PAL活力最大。当接种量超过10%时，重组PAL活力反而下降。接种量过大，菌体生长过快，菌体过早衰亡，产酶不高。接种量过低，菌体生长缓慢，发酵周期长，产酶时间延缓。 3.6 接种量对PAL酶活性的影响 图3-6 接种量对PAL酶活性的影响 3.7 发酵温度对PAL酶活性的影响 单因素实验 由图3-7可知，在温度25℃-35℃时，重组PAL活力逐渐增加，当温度为35℃时，重组PAL活力最大。当温度为40℃时，重组PAL活力反而下降。说明温度过高会影响酶活。 图3-7 温度对PAL酶活性的影响 响应面实验 表3-1 中心组合实验结果及响应值表 采用SAS软件中的RSREG程序对响应值与各因素进行回归拟合，得到回归方程： 酶活=45.83-1.90×A-3.74×B+1.04×C-0.45×A×B-0.70×A×C-1.12×B×C-4.15×A2-11.53×B2-2.33×C2 响应面实验 表3-2 参数估计及方差分析表 图a 图b 响应面实验 响应面实验 图c 图d 响应面