空肠弯曲菌fliD基因突变株的构建及其生物学特性-微生物学报.PDF

微生物学报 A cta Microbiologica Sinica 2018, 58(2): 219-227 /actamicrocn DOI: 10.13343/ki.wsxb Research Article 研究报告 空肠弯曲菌fliD 基因突变株的构建及其生物学特性 唐虹，张小燕，杜雪晴，宋召军，焦新安，黄金林* 扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心， 江苏 扬州 225009 摘要：【目的】研究fliD 基因对空肠弯曲菌生物学特性的影响，为阐明该基因的功能和作用机制奠定基 础。【方法】利用同源重组技术构建fliD 基因的插入失活突变株NCTC11168 △fliD ，并通过与野生株比 较，对 fliD 突变株生长速率、运动力、黏附力和侵袭力等生物学特性进行研究。【结果】与野生型 NCTC11168 相比，突变株 △ NCTC11168 fliD 的生理生化特性不变；突变株的生长速率无明显变化；MH 半固体穿刺实验中，突变株只能在接种处生长，运动力明显减弱；在 Caco-2 细胞黏附、侵袭实验中， fliD 突变株的黏附率和侵袭率分别为 164.00±19.49、55.00±6.09 ，fliD 基因失活使得突变株的黏附率和侵 袭率显著降低(0P0.01) 。【结论】fliD 基因是空肠弯曲菌运动能力重要的分子基础，与空肠弯曲菌感染 细胞的黏附侵袭作用密切相关，即与空肠弯曲菌的致病性密切相关。 关键词：空肠弯曲菌，fliD 基因，突变株，生物学特性 空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni ，Cj)是一类 发挥重要作用。据研究报导，鞭毛介导空肠弯曲 细胞色素氧化酶阳性、微需氧、弯曲螺旋杆状的革 菌运动[2] ，其相关基因失活会使空肠弯曲菌对细胞 兰阴性细菌，可表现出活泼的运动力。自 2005 年 的黏附侵袭能力下降[3–4] ，并影响空肠弯曲菌定殖 以来，空肠弯曲菌一直是欧盟导致人类细菌性胃 在宿主胃肠道[5] 。目前空肠弯曲菌鞭毛引起以上毒 肠炎的主要原因，每年大约造成 900 万人感染， 力表型变化的机理还不清楚，相关基因与毒力的 花费成本高达24 亿欧元[1] 。目前空肠弯曲菌的生 偶联性也没有进行分析。 态学、流行病学和病原学等方面的研究已取得了 fliD 基因是空肠弯曲菌鞭毛合成级联通路中 一定的进展，但对其致病机理的了解甚少。鞭毛 的重要元件，分析该基因的特性、功能及其与毒 是空肠弯曲菌典型的毒力因子，在其致病过程中 力的关联将会对研究空肠弯曲菌致病机理大有裨 基金项目：国家自然科学基金 ；国家支撑计划(2014BAD13B02) ；江苏省自主创新项目[CX(15)1009-2] *通信作者。Tel ：+86-514；E-mail ：jinlin@ 收稿日期：2017-03-01 ；修回日期：2017-05-29 ；网络出版日期：2017-07-10 220 Hong Tang et al. | Acta Microbiologica Sinica , 2018, 58(2) 益。本研究通过同源重组技术构建了空肠弯曲菌 1.2 fliD 突变株的构建 fliD 突变株，并对突变株的生物学特性进行了研 1.2.1 引物设计与合成：根据GenBank 上已公布 究。该研究为深入了解fliD 基因的功能，解析空 的空肠弯曲菌NCTC11168 全基因组序列，以及质 肠弯曲菌的致病机理奠定基础，为弯曲菌的预防 粒pRY107 图谱，应用软件Primer 5.0 设计引物(表 与控制提供新靶点。 1)。引物由南京金斯瑞有限公司合成。 引物fliD -F/R 用于扩增空肠弯曲菌fliD