TaqMan法进行实时定量PCR鉴定.docVIP

3.3 TaqMan法进行实时定量PCR鉴定 较普通PCR而言，实时定量PCR有更高的灵敏度，因此需要进一步优化反应条 件。PCR 反应在 Applied Biosystems StcpOncTM Real-Time PCR System (ABI 公司 仪器)sequence detector中进行。采TaqMan法进行绝对定量p() HeLa细胞中mtDNA 的拷贝数。 3. 3. 1荧光定量试剂及探针 Premix Ex Taq? (Perfect Real Time),购自宝生物工程(大连)有限公司。 PCR反应引物以及探针均由宝生物工程(大连)有限公司合成。 3. 3.2构建质粒标准品的目的片段的扩增及纯化 本试验对以往所报道拷贝数的文献进行了筛选，通过比较选用了常用的核基因中 的(}-actin基因做为的参照，Cox-I基因做为正常线粒体基因K(1，其中0-actin基 因的引物为实时荧光定量的引物，Cox-I基因的引物则为木实验室扩增线粒体全 序列的引物中的第九对引物［41］。引物所在位置、引物序列、目的片段的长度以 及复性温度见表6。引物处理、PCR试剂、反应体系等同前面扩增PCR，复性温 度依据表6。扩增目的片段并纯化之后与T载体连接。 引物名称 引物位置 引物序列(5’一3’) 目的片段长度 复性温度 p-actin F 1997-2017 ACCCACACTGTGCCCATCTAC 107 bp 58 °C (i-actin R 2103-2081 TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA Cox-IFl 5835-5855 GAGGCCTAACCCCTGTCTTT 827 bp 59 °C Cox-I R1 6661-6642 ATTCCGAAGCCTGGTAGGAT 表6 F表示正向引物，R表示反向引物。F与R用于扩增基因的一段 区域缺失区域，引物序列同荧光定量时引物序列；Cox-n F与Cox-f R1用于扩增Cox-/基 因的一段序列。 3.3.3感受态的制备(于超净工作台无菌条件下及冰上操作) 取上述1 ml培养液于1.5 ml EP管。 4 °C 4000 rpm 离心 5 min,弃上清。 加入100 pi冰中预冷的Solution A，轻轻弹动使沉淀悬浮(可轻轻吹打)。 4 °C 4000 rpm 离心 5 min,弃上清。 加入100 pi冰中预冷的Solution B，轻轻弹动使沉淀悬浮。 感受态细胞制作完成(可直接用于DNA转化实验或-80 °C保存，以备后用)。 3.3.4目的DNA片段的连接及感受态细胞的DNA转化 在微量离心管中配制下列DNA溶液，总量为5 pi。 pMD? 18-T Vector 1(il Insert DNA 0.1 pmol?0.3 pmol dH2O 补至 5 pi 加入 5 pi (等量)的 Solution Io 16 °C连接过夜(8小时)提高反应效率及连接产率。 取-80 °C保存感受态细胞冰中融化10 min。 取100 pi的感受态细胞移至新的EP管中。 向感受态细胞中加入(3-10 pi)的转化用DNA(连接产物)，轻轻混匀后冰中 放置30 min。 42 °C水浴中放置45s-60s后，立即于冰中放置1-2 min。 加入890 pi 37 °C预温的SOC培养基。 37 °C振荡培养 1 h ( 200 rpm)o 取适量于含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，将平板倒 置于37 °C培养箱中培养过夜形成单菌落，计数白色、蓝色菌落。 挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。确认培养菌落， 进行下步实验。 取3 ml LB各支加3 |il氨苄，挑取菌落于其中，37°C (150-200 rpm)轻振荡 过夜。 3.3.5使用质粒提取试剂盒提取质粒 测序以及质粒浓度的测定时对质粒DNA的纯度要求较高，本试验采用宝生 物公司的质粒提取试剂盒MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0进行质粒的 提取。该试剂盒是用于质粒(Plasmid) DNA小量纯化的试剂盒，采用了传统的 SDS碱裂解法，结合DNA制备膜技术，具有高效、快速、方便之特点，全套 操作只需1小时便可完成。使用本试剂盒可从1?4ml的过夜培养的菌液中纯 化得到1?20pg的高纯度质粒DNA (OD260/OD280= 1.8?2.0),此质粒DNA 可直接用于DNA序列分析以及各种酶促反应等。 (一)试剂盒组成 TOC \o 1-5 \h \z RNase A 1(50 mg/ml) 32(J Solution I 15 ml Solution II 15 ml Solution III 24