现代分子生物学课件-第五章.pptVIP

SNP检测技术 传统SNP检测方法：RFLP、PCR-SSCP、DHPLC等，最终均需通过凝胶电泳分析，通量受到限制，并只能判断有无，而不知碱基类型。必须进行DNA测序。 基因分型：利用数据库已有SNP进行特定人群序列和发生频率研究，包括如下方法： 1、基因芯片技术：通过优化芯片杂交程序，使探针只与完全互补的序列杂交，而不与含有单个错配碱基序列杂交。 2、Taqman技术：运用了荧光共振能量转换（FRET）技术。 3、分子信标技术：也运用了FRET技术。 4、焦磷酸测序法 SNP的应用 1、人类基因单体的绘图 2、SNP与疾病易感基因的相关性分析 3、指导用药与药物设计 5.5 基因克隆技术 在多细胞的高等生物个体水平上，人们用克隆（clone）表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。 在细胞水平上，克隆是指由同一个祖细胞分裂而来的一群带有完全相同遗传物质的子细胞。 在分子生物学中，人们把将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之得以永久保存和复制的过程称为克隆（动词）。 基因克隆，包括目的基因的分离和鉴定两个内容，分四个基本步骤： (1) DNA材料的选择与片段化； (2) 外源DNA片段与载体分子的体外连接反应； (3) 将人工重组的DNA分子导入它们能够进行正常复制的寄主细胞； (4) 重组转化子克隆的选择或筛选。 *真核生物基因（大，有重复序列）———cDNA克隆法法。 RACE（Raid amplification of cDNA ends）技术是一项在已知cDNA序列（部分）的基础上克隆5’或3’端缺失序列的技术。 主要操作步骤如图5-22所示。 RACE技术除了用于获得全长cDNA序列外，还被应用于识别获得5’和3’端非转录序列。 5.5.1 RACE技术 该法通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异性扩增目的基因片段。因为Tester和Driver在接受差示分析前均经一个4碱基切割酶处理，形成平均长度256bp的代表群，保证绝大部分遗传信息能被扩增。 5.5.2 应用cDNA差示分析法克隆基因 图5-23 RDA流程图。 1、基因大规模克隆的目的 Gateway技术利用?噬菌体进行位点特异性DNA片段重组，实现不需要传统的酶切连接过程的基因快速克隆和载体间平行转移，为大规模克隆基因组注释的可译框架提供了保障。 2、Gateway克隆技术要点 （1）Topo反应：将目的基因PCR产物连入Entry载体 （2） LR反应：将目的片断从Entry载体重组入表达载体 图5-24a，5-24b。 5.5.3 Gateway大规模克隆技术 图5-24 Gateway大规模克隆策略 基因的图位克隆法（Map-based cloning）是分离未知性状目的基因的一种良好方法。 所有具有某种表现型的基因都可以通过该方法克隆得到。首先，通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。 5.5.4 基因的图位克隆法 其次，通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的RFLP标记，通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来（图5-25）。 图5-25 染色体步移法克隆基因示意图 图5-26 用图位克隆法获得控制水稻脆杆基因BCl 1995年，首次提出了蛋白组学的概念。其是蛋白质和基因组研究在形式和内容方面的结合，致力于研究某一物种、个体、器官或细胞在特定条件、特定时间所表达的全部蛋白质图谱。 基因组是相对固定的，但各个基因的表达调控与表达程度却有时空性。 5.6 蛋白质组与蛋白质组学技术 1975年首次建立了等电聚焦及SDS-聚丙烯酰胺凝胶双向电泳技术，该方法依赖于蛋白质分子的等电点和相对分子质量的差异。 目前，双向电泳的分辨率达到每块胶10000个蛋白白点。 5.6.1 双向电泳技术 蛋白质印迹法（Western blotting），又称为免疫印迹法（immunoblotting）,用于鉴定蛋白质，其原理是根据被测蛋白质能与特异性抗体结合的特性和该蛋白质的相对分子质量。 5.6.2 蛋白质印迹法 图5-28 Western Blotting示意图 生物质谱法用于鉴定电泳分离后的蛋白质。错误率：低于百万分之一。 工作原理： 蛋白质酶解成肽段?与基质混合? 激光轰击、喷射?分析 达到检测器的时间由质量/电荷比决定?质谱图?比较分析：通过比较肽质量指纹图谱与数据库中不同肽段的理论分子质量来寻找。 5.6.3 蛋白质的质谱分析