哈维氏弧菌外膜蛋白基因ompU的克隆表达 DNA疫苗构建及对大菱鲆免疫效果探究-海洋生物学专业论文.docxVIP

独创 独创 声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含未获得 !洼!塑逡查墓丝重要挂别座塑的!奎拦亘窒2或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：王碱 签字日期：知11年／月2日 学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公 众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学 位 沦 文 惜者 签 名 王 厨 导师签字： 谬鬻 签 字 日 期 咖沙 ¨ 年 阳 青， 日 摘 摘 要 哈维氏弧菌是一种革兰氏阴性菌，被认为是引起发光弧菌病的主要病原性弧 菌。发光性弧菌病已经影响到大范围的海洋无脊椎动物，已有报道称很多国家养 殖对虾的大量死亡是受到了哈维氏弧菌的感染引起的。哈维氏弧菌也与中国和南 亚各国的鱼类细菌性疾病有关，其广泛的致病性和给水产养殖业造成的严重影响 引起了世界范围的广泛关注。 本研究的主要目的是从致病性哈维氏弧菌SF．1中克隆和表达一种外膜蛋白 OmpU，探究其作为疫苗候选基因在大菱鲆对抗哈维氏弧菌感染时的免疫效果。 在本实验中，一种外膜蛋白基因ompUJ叭致病性哈维氏弧菌SF．1基因组中克 隆，并在大肠杆菌原核表达系统．中得到表达。omp滢因编码一个35kDa的蛋白， 此蛋白可以通过Ni亲和柱亲和层析的方法得到纯化。将omp继因插入到真核表 达质粒载体pEGFP．N1中，制备成DNA疫苗。通过RT-PCR检测证实 pEGFP-N1／ompU可以在大菱鲆肌肉组织内得到表达。纯化的外膜蛋OmpU和重 组质粒pEGFP-Nl／D，印嘲过肌肉注射的方式分别对大菱鲆进行免疫，实验结果 显示，OmpU蛋白疫苗在对抗致病性哈维氏弧菌SF．1中可以达到很好的保护效 果，实验组大菱鲆在攻毒试验中的免疫保护率达到100％，DNA疫苗 pEGFP．N1／ompU免疫组大菱鲆也起到了很好的保护效果，免疫保护率达到 51．4％。通过间接ELISA可以检测到免疫组大菱鲆体内的特异性抗体反应。 综上所述，我们从致病性哈维氏弧茵SF．1基因组中克隆和表达了一种外膜蛋 白基因ompU，此蛋白被用于制作亚单位疫苗，重组质粒pEGFP—N1／ompU的DNA 疫苗也被构建和在体内表达，对于免疫过的实验组大菱鲆来讲，无论是蛋白疫苗 还是基因疫苗，在对哈维氏弧菌的感染中均可以起到较高水平的保护，引起显著 的特异性抗体免疫。实验结果显示，omp罐因被认为是一种有效的疫苗候选基 因，可用于研制亚单位疫苗和DNA疫苗预防由致病性哈维氏弧菌引起的鱼类养 殖类疾病。 关键词： 哈维氏弧菌，外膜蛋白，DNA疫苗．大菱鲆，免疫 ]dent i f I cat I on and eva I uat i on ot an oute r membrane prote i n OmpU from a pathogen i C Vibrio harveyi i SO I ate as vacc i Re cand i date i n turbot(ScophthaImus maximus) Abstract Vibrio harveyi is a Gram-negative bacterium．The bacterium has been reported as major causal agent of luminous vibriosis，which affected a diverse range of marine invertebrates．Mass mortalities of shrimp larvae due to矿harveyi infection have been reported from a number of cotmtfies．矿harveyi has also been associated with fish diseases in China and South Asian countries． The main