山羊胎儿成纤维细胞中基因打靶的初步研究.PDF

文献参考 No. 10 山羊胎儿成纤维细胞中基因打靶的初步研究 摘要 为评估在山羊胎儿成纤维细胞中通过同源重组进行基因打靶的可行性，构建打靶载体 p Target1，分别以山羊β2 酪蛋白基因 r 的5’、3’ 侧翼区为2 条同源臂，中间插入正筛选基因（Neo ），外侧插入负筛选基因（HSV2tk ）。将该载体线性化并纯化后电 转染入 30 日龄的山羊胎儿成纤维细胞中，转染细胞系分别用G418 和丙氧鸟苷进行正负药物筛选，存活细胞经 PCR 检测证 明发生了同源重组事件。 关键词：山羊；胎儿成纤维细胞；基因打靶；同源重组 简介 基因打靶是通过外源 DNA 与染色体 DNA 之间的同源重组 仅适用于一些在所用细胞中能表达的基因位点，而为了满足 精确地修饰和改造基因组 DNA 的技术。它是在胚胎干细胞 打靶过程中对细胞反复扩增的要求，研究者一般选用胎儿成 和同源重组基础上发展起来的，具有位点专一性强、打靶后 纤维细胞，这就限制了能有效进行打靶的基因位点。例如， 目的基因片段可以与染色体 DNA 共同稳定遗传的特点，是 一些乳蛋白基因仅在特定条件下的乳腺上皮细胞中表达，就 一种较理想的改造生物遗传物质的实验方法。1989 年， 无法用启动子诱捕法在胎儿成纤维细胞中实现基因打靶。而 [1] 运用经典的含正负筛选的同源重组法进行基因打靶就不受基 Capecchi 等 首次报道了基因打靶小鼠的诞生，但是此后 很长一段时间内对动物的基因打靶仅局限在小鼠上，因为其 因活性的限制，其运用范围更广。但是，打靶效率与启动子 他动物能发育成生殖细胞的胚胎干细胞一直未能分离成功。 诱捕法相比要低许多，若要筛选到定点整合的细胞则更困难。 [2] 体细胞核移植的成功 为制备基因打靶动物提供了一条新 的途径。目前，已经在猪和绵羊的一些基因位点实现了基因 为评估在山羊胎儿成纤维细胞中通过同源重组进行基因打靶 打靶，包括胶原酶原 1 基因（COL1A1 ）、α21 ,32 半乳糖转 的可行性，作者首先从乳腺特异性表达载体中获得山羊β2 [3] r 移酶基因 （GGTA1）和原蛋白基因（PrP） 。但是这些例 酪蛋白基因调控序列，并构建含有抗性基因 Neo 基因和 子中绝大多数都是采用启动子诱捕法 （Promoter t rap），而 HSV2tk 基因的打靶载体，可分别进行细胞的正负药物筛选， 不是用同源重组法得到的。用启动子诱捕法最大的缺陷就是， 为下一步制备精确基因打靶的克隆山羊打下基础。 材料与方法 1.1.1 仪器和试剂 1.1.3 山羊胎儿成纤维细胞系的建立 CO 培养箱（美国 Forma Science 公司），Eppendorf [5] 2 公、母萨能奶山羊配种 30 d 后用外科手术法取出胎儿 , Multiporator 电转染仪（德国 Eppendorf 公司），DMEM 常规方法分离培养胎儿成纤维细胞。 培养基（美国 Gibco 公司），FCS （美国 Hyclone 公司）， 1.1.4