含mdr1基因质粒pMDR2000以mRNA形式转导脐血单个核细胞的体外研究-肿瘤学专业论文.docxVIP

缩略词表缩写 缩略词表 缩写 英文全称 中文全称 Amp ampicilin 氨苄西林 AUC area under t}le ClLrVe 曲线下面积 bp base pair 碱基对 cDNA complementary DNA 互补DNA DNA deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸 dNTP deoxy-nucleosides triphosphates 脱氧核糖三磷酸 EB ethidium bromide 溴化乙锭 EP eppendorf tube 微量离心管 FCM flow cytometer 流式细胞仪 kd kilodlton 千道尔顿 mdrl multidrug resistance gene 1 多药耐药基因1 mRNA messager ribonucleic acid 信使核糖核酸 OD opfical density 光密度 P—gP P-glycoprotein P一糖蛋白 Rnasin RNA enzyme inhibitor RNA酶抑制剂 rpm rotation per minute 每分钟转 SDS sodium dodecylsulfate 十二烷基硫酸钠 摘 摘 要 背景： 化疗在恶性肿瘤治疗中占有重要的地位。然而，反复和大剂量化 疗带来的骨髓抑制，影响了化疗方案的正常实施。近年来应用富含造 血干细胞的脐血单个核细胞移植治疗各种疾病造成的骨髓抑制已有 成功的临床报道。而化疗药对造血干细胞的毒性使移植后血像不能正 常维持。多药耐药基因(mdrl)编码一种分子量为170kD的跨膜糖 蛋白P-gp，又称P170。其可将多种细胞毒性药物如阿霉素 (Doxorubicin)、长春新硷(VCR)及秋水仙素(Colchicine)等排出细胞 外，从而使细胞产生对于上述药物的耐药性。目前采用的以逆转录病 毒为载体的基因转导用于治疗骨髓未受侵犯的晚期乳腺癌、卵巢癌和 一些脑部肿瘤患者的临床治疗方案，得到美国食品药品管理局 (Food and Drug Administration，FDA)批准，至今已进入二期临床试 验，初步结果显示出一定的临床应用的价值。但以逆转录病毒为载体 的DNA转导仍存在一定的局限性。 目的： 本研究拟将包含人类mdrl基因全长的野生型cDNA以mRNA 形式导人人脐血单个核血细胞。观察在转染后单个核血细胞中mdrl 基因的翻译，r,-gp蛋白的表达和功能情况及细胞对化疗药的耐性是否 增加。 材料： 包含人类mdrl基因全长的野生型cDNA质粒pMDR2000由美国 NIH的Micheal Gottcsman博士惠增。 脐血为本院产科病房采集。 力怯： 一、人mdrl mRNA的体外合成及修饰。 本研究采用基因克隆的方法，经酶切、连接等一系列分子生物学 操作获得了可使用SP6转录酶进行体外转录的模板分子 pGEM4ZMDR2000，并经体外转录获得目的mRNA。 二、脐血单个核血细胞的采集，分离和体外培养 本研究采取脐血，用淋巴细胞分离液法分离得到富含造血干细胞 的人单个核血细胞。在体外无血清及细胞因子存在下短期培养。 三、mdrl mRNA的转染和P-即表达和功能的检测。 经脂质体介导mdrl mRNA的转染脐血单个核血细胞，采用 RT—PCR方法检验mRNA转染效率，Western RT—PCR方法检验mRNA转染效率，Western Blot检测蛋白翻译水平， 流式细胞技术分别分析蛋白在细胞膜上的表达及蛋白功能水平，细胞 活率计数分析转染后细胞耐药性。 结果： 通过基因克隆技术成功构建了质粒pGEM4ZMDR2000，并经体外 转录获得了目的mRNA。无血清及细胞因子存在条件下，成功转染造 血干细胞。转染后细胞mRNA相对含量(I．380)明显高于对照组 (1．105)；Western Blot可见转染组mdrl基因编码的P—gP蛋白条带 增强；流式细胞仪分析转染后9．05的细胞表面表达P—gP蛋白，而对 照组则为O；罗丹明123排泌试验发现转染组98．72的细胞有排泌功 能，而对照组仅为66．83；细胞活率计数表明转染组细胞耐药性明显 强于对照组(弘，o．01)。 结论： 通过脂质体介导，无血清环境下，将人类mdrl基因野生型全长 mRNA转导入脐血单个核血细胞，增加了细胞内mdrl基因mRNA的 含量，增加了mdrl基因编码的P．gp蛋白的表达，提高了细胞的耐药 性。对基因转导后脐血输注，缓解和治疗恶性肿瘤化疗带来的骨髓抑 制，作了应用于临床前的基础研究，并证实其可行性。 关键词：多药耐药基因mRNA脐血 AbstractBack Abstract Back ground Chemothempy plays a great role in