免疫电泳技术.ppt

PPT课件 免疫电泳技术 * PPT课件 免疫电泳技术 是将电泳与免疫扩散相结合的一种常用的免疫学实验方法 。 * PPT课件 沉淀反应 是可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合所出现的沉淀现象。 * PPT课件 分类 液体内沉淀试验 絮状沉淀试验 环状沉淀试验 免疫浊度测定 凝胶内沉淀试验 免疫扩散 免疫电泳 单向琼脂扩散试验 双向琼脂扩散试验 火箭免疫电泳 对流免疫电泳 沉淀反应 * PPT课件 火箭免疫电泳 是将单向免疫扩散和电泳相结合的一种定量检测技术。 定量的抗原加入到含有一定量的相应抗体的琼脂糖凝胶中，在电场的作用下，引起抗原抗体的迁移和相互反应，当抗原与抗体分子达到适当比例时，形成一个形状如火箭的不溶性免疫复合物沉淀峰，峰的高度与待捡样中的抗原浓度呈正相关。 * PPT课件 * PPT课件 应用 当琼脂中抗体浓度固定时，以不同稀释度标准抗原泳动后形成的沉淀峰为纵坐标，抗原浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的沉淀峰长度即可计算出待测抗原的含量；反之，当琼脂中抗原浓度固定时，便可测定待测抗体的含量(即反向火箭免疫电泳)。 * PPT课件 对流免疫电泳 将双向免疫扩散与电泳相结合的一种技术。 此法操作简便，仅需30～60分钟，灵敏度比双向扩散高10～15倍；但缺点是特异性不如双向琼脂扩散高。 * PPT课件 实验原理 实质上是定向加速的双向免疫扩散技术。 在pH8.6的缓冲液中，蛋白质抗原带负电荷向正极泳动；而抗体大部分属于Ig，由于分子量大，暴露的极性基团较少，在离子琼脂中泳动缓慢，同时受电渗作用的影响向负极泳动，在抗原抗体相遇的最适比例处形成乳白色沉淀线。 * PPT课件 电渗是指在电场中液体对于一个固定固体的相对移动。琼脂是一种酸性物质，在碱性溶液中带负电荷，而与它接触的溶液带正电荷，因此液体向负极泳动，产生电渗 * PPT课件 * PPT课件 沉淀线形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度的关系 A：Ag、Ab浓度及扩散率近似； B：Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag＞ Ab ； C：Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag＜ Ab ； D：扩散率近似，浓度Ag ＞ Ab ； E：浓度Ag ＞ Ab，扩散率Ag ＞ Ab ； F：浓度Ag ＜ Ab，扩散率Ag ＜ Ab * PPT课件 材料和试剂 1、AFP诊断血清： 2、肝癌病人血清：（阳性对照） 3、待检血清：人血清 4、阴性对照血清：正常人血清 5、pH8.6、离子强度0.05M巴比妥缓冲液 6、离子琼脂：用巴比妥缓冲液配制。 7、电泳仪 8、其他：打孔器、移液器，枪头 * PPT课件 操作步骤 琼脂糖凝胶板的制备 打孔、加样 电泳 结果观察 影响结果的因素 * PPT课件 制板、加样、打孔 用吸管吸取4ml加热溶化的琼脂铺在载玻片上,待凝。 打孔:用打孔器在琼脂板上打孔(孔距4mm),如图。 加样:将待测抗原样品约10ul加在阴极侧孔内,抗血清加在阳极侧,加样时应加满小孔但不能溢出 * PPT课件 Ab Ag Ab：甲胎蛋白诊断血清 Ag：1、肝癌病人血清（阳性对照） 2、正常人血清（阴性对照） 3、待测血清 1 2 3 * PPT课件 电泳 将加好样品的板置于电泳槽上，抗原孔置负极端，抗体孔置正极端。琼脂板两端分别用四层纱布与0.05mol/L、PH8.6的缓冲液相连，接通电源。电流以玻片的宽度计算，为4mA/cm；电压以玻片的长度计算，为6V/cm；通电30-60min后，切断电源，观察结果 * PPT课件 PPT课件