circRNA慢病毒表达载体pLO5-ciR.PDF

Rev: circRNA 慢病毒表达载体pLO5-ciR 货号 产品名称 规格 运输与保存 GS0107 pLO5-ciR 2 ug 4 ℃运输，-20 ℃保存 产品介绍： 第五代circRNA 表达载体pLO5-ciR 含有吉赛生物专利技术的circRNA 表达框架，含有精心改造 的Alu 元件、QKI 等RBP 的结合位点，并使用全新设计的环化介导序列，能保证插入的circRNA 准 确高效率环化。表达框架中间预留EcoRI 和BamHI 酶切位点，可直接通过酶切连接插入目的circRNA 片段。本载体能同时表达Puromycin 抗性基因，可以方便地进行筛选。 使用载体文章引用格式：pLO5-ciR (Geneseed Biotech, Guangzhou, China), 中文引用格式：pLO5-ciR （吉赛生物，广州）。 产品特点：  过表达效率高：专利技术的circRNA 表达框架能使circRNA 显著过表达50 倍以上。  环化准确性高：特有的环化介导序列能有效保证目的circRNA 环化无碱基添加或缺失。  过表达稳定性高：对200 nt 到2500 nt 的circRNA 都能实现准确高效过表达。 使用说明： 1.载体准备 载体上EcoRI 和BamHI 酶切位点中间加入了一段45 bp 的Stuffer，使用前需先以EcoRI 和BamHI 对载体双酶切去除Stuffer 并回收开环空载体，然后与经双酶切的目的circRNA 片段进行连接。 2.克隆引物设计 按照一般的PCR 引物设计规则设计扩增circRNA 线性序列的引物，设计好后需在正向引物5’端 加入EcoRI 酶切位点、正向环化介导序列和AG 受体，反向引物5’端加入BamHI 酶切位点、反向环 化介导序列和GT 供体。 Primer-F ： 5’ CGGAATT CTAATACTTTCAG+原引物序列 3’ Primer-R ： 5’ CGGGATCCAGTTGTTCTTAC+原引物序列 3’ PCR 产物结构如下： 3.测序鉴定 测序鉴定需在目的circRNA 片段中部设计两条引物，双向交叉测序，两条引物间隔不短于90bp 。 若目的circRNA 序列小于700bp ，可直接以克隆引物双向测序。 注意事项： 以此载体包装慢病毒应使用psPAX2 、pMD2.G 两个辅助质粒。 常见问题： PCR 产物纯化后再进行酶切 PCR 产物和空载体酶切产物纯化后进行连接反应 克隆效率低 调整连接体系中插入片段与载体的比例，若使用T4 DNA Ligase，推 荐使用插入片段与载体的摩尔比为1:1 到5:1 优化PCR 条件 挑取更多单克隆进行PCR 鉴定 菌液PCR 鉴定无阳性克隆 测序鉴定选取的单克隆 选取的单克隆抽提质粒后进行酶切鉴定