四-菌种保藏的原理和方法.ppt

第三节 菌种保藏与复壮 一、菌种保藏 菌种保藏的重要意义： 菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产，如抗生素、氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。其任务首先是使菌种不死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。 菌种是国家的重要资源，1980年我国成立了中国微生物菌种保藏委员会。 第四章 菌种保藏的原理与方法 一 菌种保藏的原理： 菌种保藏主要是根据菌种的生理、生化特性，人工创造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。 保藏时，一般利用菌种的休眠体（孢子、芽孢等），创造最有利于休眠状态的环境条件，如低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等，以降低菌种的代谢活动，减少菌种变异，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力，达到长期保存的目的。 一个好的菌种保藏方法，应能保持原菌种的优良特性和较高的存活率，同时也应考虑到方法本身的经济、简便。 二、工业微生物菌种保藏技术： 1. 斜面低温保藏法 2．矿物油中浸没保藏法 3．固体曲保藏法 4．砂土管保藏法 5. 普通冷冻保藏 6．超低温冷冻保藏法 7. 冷冻干燥法 8. 液氮冷冻保藏法 9. ?寄主保藏 1.斜面低温保藏 本方法是利用低温降低菌种的新陈代谢，使菌种的特性在短时期内保持不变。 将新鲜琼脂培养基斜面上长好的菌体或孢子，置于4℃冰箱中保存。一般的菌种均可用此方法保存1～3个月。 保存期间要注意冰箱的温度，不可波动太大，不能在0℃以下保存，否则培养基会结冰脱水，造成菌种性能衰退或死亡。 此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设备。可用于实验室中若干菌种的保藏。 但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变 因此要求在基本培养基上传代为好，目的是能淘汰突变株；同时转接菌量应保持较低水平。 斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏，以防止培养基脱水并能降低代谢活性。 此方法是一种短期、过渡的保藏方法此方法，一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏，一般保存时间为3~6个月。如放线菌于4~6℃保存，每3个月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6个月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6个月移接一次。 2. 矿物油中浸没保藏 将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室温或4℃冰箱保存，此方法简便有效。保存期约1年。 可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。 浸没保藏的操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经170℃下灭菌1-2h的矿物油(液体石蜡可采用蒸汽灭菌，灭菌后的石蜡在40℃烘箱中烘干备用)。矿物油的用量以高出培养物1cm为宜。 以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验。因为某些菌株在液体石蜡下生长还十分明显，有些菌株如某些假丝酵母还会同化液体石蜡，也有的对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏。为了预防不测，一般保藏株2～3年也应做一次存活试验。 3. 固体曲保藏法 这是根据我国传统制曲原理加以改进的一种方法，适用于产孢子的真菌。该法采用麸皮、大米、小米或麦粒等天然农产品为产孢子培养基，使菌种产生大量的休眠体（孢子）后加以保存。该法的要点是控制适当的水分。 4 砂土管保藏法 本方法是用人工方法模拟自然环境使菌种得以栖息。适用于产孢子的放线菌、霉菌以及产芽孢的细菌。 砂土是砂和土的混合物，砂和土的比例一般为3：2或1：1，将黄砂和泥土分别洗净，过筛，一般沙用80目过筛，土用80～100目过筛。按比例混合后，装人小试管内，装料高度约为1cm左右，121℃间歇灭菌2～3次，灭菌后烘干，并作无菌检查后备用。 将要保存的菌种斜面孢子刮下，直接与砂土混合；或用无菌水洗下孢子，制成悬浮液，再与砂土混合。混合后的砂土管放在盛有五氧化二磷或无水氯化钙的干燥器中，用真空泵抽气干燥后，放在干燥低温环境下保存。此法保存期可达1年以上。 5.普通冷冻保藏 由于该法的保藏温度为－20℃，为了避免微生物受损伤致死，需要甘油作为保护剂。甘油的最终浓度为25%。 具体操作如下：①配制浓度为50％的甘油溶液，121℃灭菌后备用；②制备菌悬液，一般菌悬液的浓度为108～1010个／mL；③将菌悬液和甘油溶液以等体积混合均匀后，置－20℃保藏。 或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。 用此方法可以维持若干微生物的活力1—2年。 应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。 保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。 这一方法虽简便易行，但不适宜多