海马脑片方法学的建立以及在脑损伤研究中的应用-药理学专业论文.docx

浙江大学硕士学位论文海马脑片方法学的建立以及 浙江大学硕士学位论文 海马脑片方法学的建立以及 在脑损伤研究中的应用 浙江大学医学院药理学 2000硕士研究生： 李伟 导 师： 魏尔清教授 摘要 ， l脑损伤导致神经元死亡的两个主要机制是：氨基酸兴奋性毒性(amino acid excitotoxicity) ＼、 和自由基损伤(free radical damage)。脑缺氧或其他损伤时，大量谷氨酸释放，C2+内流，细胞 内Cd+上升，最终导致细胞的损伤。离子型谷氨酸受体包括NMDA受体和非NMDA受体， 后者又可分为AMPA受体和KA受体：其中NMDA受体在脑损伤中的作用受到关注。ROS (reactive oxygen species)包括超氧阴离子(superoxide anion)，羟自由基(hydroxyl radical)， 过氧化氢(hydrogen peroxide，H202)等。ROS的毒性作用包括脂质过氧化物(1ipidperoxidation) 的形成，线粒体呼吸链酶的抑制，膜Na+．K+．ATPase的抑制，以及其它蛋白的氧化修饰作用。 其中H202通过Fenton reaction，与铁、铜等金属离子发生反应，产生羟自由基(hydroxyl radicals，．OH)产生毒性作用。y 本实验室已经建立了离体脑片缺血模型，为了在脑片水平更深入研究脑损伤的机制。首 先，必须完善制备海马脑片的方法，制备能够维持海马长时间活性的浴槽，以及建立海马脑 片的细胞外电生理等方法。本研究建立海马脑片制各、浴槽设计以及细胞外电生理等方法； 在此基础上，建立海马脑片缺血模型和观察药物治疗作用的方法；最后初步探讨了H202对海 马脑片损伤作用的机制以及自由基损伤与兴奋性毒性之间的关系。通过本研究，希望能够为 ●■-_M_■■■■l-_■■■■●_‘■一 今后更深入研究海马脑片生理、药理特点打下坚实的基础，另外能够阐明H202致脑损伤的特 点，为今后开发抗脑损伤药打下必要的基础。 海马脑片研究方法学的建立 浙江大学硕士学位论文大鼠断头取脑切片，所有的过程均在冰冷的状况下操作。用巴斯德管和沾有脑脊液的毛 浙江大学硕士学位论文 大鼠断头取脑切片，所有的过程均在冰冷的状况下操作。用巴斯德管和沾有脑脊液的毛 笔转移海马脑片，避免外界物质直接接触造成海马损伤。将制备好的海马脑片转移至气·液交 界式浴槽。气．液交界式浴槽包括内室和外室。内室主要为嵌入体，用于放置海马脑片。外室 主要作用是用预热的水蒸汽湿化脑片，并提供足够的氧气。本实验设计的浴槽有两个显著的 特点：一方面是气．液交界的方式，可以保证脑片有充分的氧气供应。另一方面，脑片周围充 分的液体交换，可以保证代谢产物的排泄。通过减少嵌入体上的尼龙网与底部的距离代替减 少内室的直径，缩小内室的体积，最终加快了脑片周围的液体交换速度。另外用流入口和流 出口分别位于其直径的1，3处来代替设置在两边，也可以加快脑片周围的液体交换速度。利用 电生理、生化、形态方面来验证浴槽的可行性。细胞外电生理结果表明，稳定8 h和l h的海 马脑片相比较，海马脑片的CAl区锥体细胞记录到的群峰电位没有显著差异。TTC染色结果 表明，在稳定1 h与8 h之间保持平稳，OD490值分别为O．244±0．02和0．235±O．03，两 者之间没有显著的差异。电镜检查结果表明，经稳定8 h后的脑片锥体细胞，细胞核呈圆型或 椭圆型；核与胞浆比例较大；核内常染色质呈颗粒状均质分布，异染色质量少；突触结构清 晰；与稳定l h后的脑片锥体细胞核以及突触比较没有显著的差异。甲苯胺蓝染色结果表明， 经稳定8 h盾的脑片锥体细胞有规则地紧密排列，细胞大而明显，膜完整而光滑，胞体呈椭圆 型，细胞中央有一个大而圆的细胞核，核异染质量少：与稳定1 h后的脑片锥体细胞比较没有 显著的差异。这些结果证明本装置可以至少8 h内保持海马脑片的活性。 2、缺氧缺糖诱导大鼠海马脑片电生理改变以及药物作用 利用我们设计的浴槽与细胞外电生理方法，来观察缺氧缺糖(oxygen and glucose deprivation，OGD)对海马脑片群峰电位的影响。OGD 4 rain，恢复供氧和葡萄糖l h后Ps波 幅上升至OGD前的(29．4±6．2)％，OGD 7min，恢复1 h后Ps波幅上升至OGD前的(17．2 ±61)％：缺氧缺糖10min，恢复1 h后Ps波幅没有回升。因此，选择4minOGD损伤模 型来观察药物的作用。 氯胺酮10和100 Imaol，L明显地提高PS波幅的恢复程度，分别达到(82．8±11．8)％ 和(69．2 4-10)％。依达拉奉1和10lunol／L明显增强Ps波的恢复程度，分别达到(56± 1