海湾扇贝金属硫蛋白cDNA序列克隆及其在镉和鳗弧菌诱导下的表达研究 水生生物专业论文.docx

研究生学位论文海湾扇贝金属硫蛋白cDNA序列克隆及 研究生学位论文 海湾扇贝金属硫蛋白cDNA序列克隆及 其在镉和鳗弧菌诱导下的表达研究 删嶝 ㈣名啦越 啊渊砸±．蝴壅生塑 鼬凶塔辩日朝；I!!垒璺当E壁县!垒旦学档授予日期；!!薹堕当E壁县 中国海洋大学 海湾扇贝金属硫蛋白cDNA序列克隆及其在镉和鳗弧菌诱导下的表达研究海湾扇贝金属硫蛋白cDNA序列克隆及其在镉和鳗弧菌诱导 海湾扇贝金属硫蛋白cDNA序列克隆及其在镉和鳗弧菌诱导下的表达研究 海湾扇贝金属硫蛋白cDNA序列克隆及其在镉和鳗弧菌诱导 下的表达研究 摘要 海湾扇贝是我国1982年从美国引进的优良海水养殖品种，并于1991年再 次引进复状，和栉孔扇贝一起构成了我国海洋贝类养殖业的主体。尽管我国的 海洋贝类养殖规模在过去的几十年中达到一定水平，养殖总产量也居国际领先 地位，但近年来，养殖扇贝病害不断爆发流行，造成大规模死亡，经济损失十 分惨重。引起扇贝大规模死亡的原因是多方面的，其根本原因则是养殖环境的 恶化和扇贝种质的衰退，抗病力下降。所以，在积极调整产业结构、加强环境 治理、开展扇贝病原及流行病学研究的同时，改良种质增强扇贝的抗病抗逆能 力则是解决困扰扇贝养殖业健康可持续发展的根本保证。扇贝中抗逆抗病基因 的克隆和表达无疑是研究养殖动物免疫防御机制，提高机体抗病力，实现遗传 改良的基础和关键。 金属硫蛋白普遍存在于生物体内，具有低分子量、富含半胱氨酸、诱导性 强等特点。金属硫蛋白具有很强的金属结合能力和氧化还原能力，在生物体内 参与细胞内金属水平的稳态调节、重金属解毒、清除自由基、抵抗电离辐射等， 具有较强的生物学功能。本研究从海湾扇贝cDNA文库中分离、克隆海湾扇贝 金属硫蛋白基因，并研究其在重金属和病原刺激下的表达规律，以阐明金属硫 蛋白作用机理和激活途径，探讨它在扇贝应激反应和免疫防御过程中的作用， 为全面地研究扇贝的免疫防御体系，培育抗病抗逆的扇贝优质品种奠定基础。 首先采用表达序列标签法，结合cDNA末端快速扩增技术，获得了海湾扇 贝(彳rg印Pcf跏打dd抽瑚)金属硫蛋白(AIMT)的全长cDNA序列。该序列全 长664bp，5’UTR(I抽n彻slated Re百on)为41bp，3’u1R为290bp，开放阅读 框(0pen Reading Fra瑚le，oRF)长度为333bp，可以编码110个氨基酸。在其 编码的氨基酸序列中半胱氨酸(cys)含量最高，占25．5％，其次是甘氨酸(Gly) 和丙氨酸(Ala)各占10．9％，赖氨酸(Lys)和丝氨酸(ser)各占8．2％，不含组氨酸 海湾扇贝金属硫蛋白cDNA序列克隆及其在镉和鳗弧菌诱导下的表达研究和芳香族氨基酸(Phe、Trp、1W)。对其编码的氨基酸序列进行分析发现该序 海湾扇贝金属硫蛋白cDNA序列克隆及其在镉和鳗弧菌诱导下的表达研究 和芳香族氨基酸(Phe、Trp、1W)。对其编码的氨基酸序列进行分析发现该序 列有无脊椎动物和软体动物金属硫蛋白的保守序列模式CKcⅪo(cXCX，c一 末端基本符合软体动物MT序列模式cxc．x(3)一c—T_G．x(3)一c．x．c_x(3)．c．x—c—K， 但是C—t．x(3)代替了c．T-G-x(3)，末尾由R代替了K。序列特征分析的结果表明 该序列具备金属硫蛋白的典型特征，是金属硫蛋白家族的成员。根据1999年 BiIlz金属硫蛋白分类方法可将该金属硫蛋白归为F锄ily2：molluscMTs， Sub胁ily In0：othcr mollusc MTs。海湾扇贝金属硫蛋白基因序列的克隆为深入 研究金属硫蛋白家族的进化过程以及贝类金属硫蛋白的多样性，理解其结构与 功能的关系提供了理论基础。 根据所获得的cDNA序列设计一对RT-PcR引物，用半定量RT-PcR的方 法在转录水平上检测了海湾扇贝血细胞金属硫蛋白基因在不同浓度镉刺激下 的表达情况。在未受镉刺激的空白组可检测到金属硫蛋白基因的表达，与B—actin 基因的比值约为O．16。在低浓度镉刺激下(50鹏／L)，AIMT表达量有所增加， 与p_actin基因的比值增加到O．28，至中高浓度组(100嵋／L、200pg／L)，这一 比值增加到了O．5l和O．60，说明重金属镉能够诱导海湾扇贝金属硫蛋白基因的 表达，并且基因的表达水平随镉离子浓度增加而上升，显示AIMT与镉的解毒 有关并具有作为指示养殖环境中镉污染水平的生物标志物的潜力。 采用荧光定量PcR的方法检测了鳗弧菌刺激后的不同时间点，海湾扇贝 血细胞金属硫蛋白基因的表达。感染后2小时，AIMT的表达量显著上升，达 到空白组的15．95倍，在此后的4、6、8、16小时表达量分别是空白组的489．18， 1059．89，2633．32和437