Elisa实验品步骤及相关材料.docVIP

本实验室Elisa所需试剂器材 1.　试剂 　　(1)　包被缓冲液 碳酸盐缓冲液(PH9.6 0.05M)： 　　　　　　Na2CO3 1.59g 　　　　　　NaHCO3　 2.93g 　　　　　　加蒸馏水至1000ml 作用：稀释抗原（菌悬浮液） (2)　洗涤缓冲液PBST (PH7.4 0.15M)： 　　　　KH2PO4 　　　　　0.2g 　　　　　　Na2HPO4·12H2O　　2.9g 　　　　　　NaCl　　　　　　　8.0g 　　　　　　KCl　　　　　　　　0.2g 　　　　　　Tween-20　0.05％　0.5ml 　　　　　　加蒸馏水至1000ml 作用：洗涤 (3)　缓冲液PBS (PH7.4 0.15M)： 　　　　　　KH2PO4 　　　　　0.2g 　　　　　　Na2HPO4·12H2O　　2.9g 　　　　　　NaCl　　　　　　　8.0g 　　　　　　KCl　　　　　　　　0.2g 　　　　　　加蒸馏水至1000ml 作用：制备封闭液 (4)　封闭液：牛血清白蛋白(BSA) 0.1g，加缓冲液（PBS）至100ml 或PBS加2％BSA 作用：封闭空隙 (5) 稀释液： PBST加1％牛血清白蛋白(BSA) 作用：稀释抗体及酶标抗体 (5)HRP羊抗兔IgG一酶标抗体 作用：结合抗体 　　(6)　底物缓冲液 磷酸盐柠檬酸(PH5.5): 　　　　0.2M Na2HPO4(28.4g/L) 25.7ml 　　　　0.1M 柠檬酸(19.2g/L)　 24.3ml 　　　　蒸馏水50ml 作用：制备TMB 　　(7)　TMB(四甲基联苯胺)使用液: 　　　　TMB(10mg/5ml无水乙醇) 0.5ml 　　　　底物缓冲液(PH5.5)　　　 10ml 　　　　0.75％H2O2　　 　32μl 作用：显色 (8)　终止液(2M　H2SO4）：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml 作用：终止反应 2.　器材: 　聚苯乙烯塑料板(酶标板)96孔 抗原制备： 以平板划线法将供试菌菌接种于普通营养琼琼脂培养基上，28 ℃培养24 h 后，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，过夜培养； 5 000 r·min-1离心10 min，弃上清；加入1%的甲醛于37 ℃灭活24 h，通过菌落涂布法检测灭活效果； 5 000 r·min-1离心10 min，弃上清，用麦氏比浊法，配制出浓度约为1×109 cells·mL-1的菌悬液作为免疫抗原。 抗血清制备： 抗血清不能直接用于包被，应先提取IgG。大量工作表明，只用硫酸铵沉淀就可以得到足够纯度及高活性的IgG蛋白。其基本步骤如下：(1)??取抗血清0.2 ml；(2)??加生理盐水（0.85％ NaCl）0.3 ml，混匀；(3)??逐滴加入饱和 (NH4)2SO4 0.5 ml，充分振荡混匀，4℃静置1 h；(4)??10000 rpm/min离心20 min，弃上清；(5)??加0.5 ml生理盐水重悬浮，混匀； (6) 0.25 ml饱和 (NH4)2SO4，充分振荡混匀，4℃静置1 h；(7)??10000 rpm/min离心20 min，弃上清； (8) 重复5～8步骤一次；(9)??加生理盐水0.5 ml重悬浮，混匀；(10)??生理盐水中透析12～24 h；(11)??在0.2 M pH 9.0硼酸缓冲液透析12～24 h；(12)??分装，即将使用时4℃保存，备用-20℃保存。为最大限度保持抗体活性，整个过程应在4℃下进行。对于冻干抗血清或长时间保存的血清，将生理盐水透析改为3 M KCNS透析，促使聚合的多聚体解聚。 硫酸铵法纯化血清IgG 粗品: 取1份血清加入1份生理盐水进行稀释, 边搅拌边加入2倍原血清体积的饱合硫酸铵, 室温放置30min, 7 000r / min离心30min; 沉淀溶于原血清体积的生理盐水中, 加入1倍体积的饱合硫酸铵, 室温放置30min, 重复第二步, 将沉淀溶于1/ 10原血清体积的生理盐水溶液中, 在0. 0175 mol/ L pH6. 3 PB 缓冲液中透析至无NH4+为止。 免疫血清效价的测定：　 采用试管凝集法测定抗血清的效价。 ELISA检测流程：　 用pH 9.6的0.05 mol/L 碳酸盐缓冲液稀释抗原，加入96孔聚苯乙烯酶标反应板孔内，每孔100 μL，60 ℃烘干，用PBST缓冲液（注满孔）洗涤3次；每孔加入300 μL 2％BSA -PBST封闭液，37 ℃封闭1 h，PBST缓冲液洗涤3次；每孔加入100 μL 适当稀释的阳性血清和阴性血清，37 ℃反应1 h，PBST缓冲液洗涤3次；每孔加入100 μL的羊抗兔I