毛细管胶束电动色谱测定基因组DNA甲基化水平-中华预防医学杂志.PDF

生堡塑陵匿堂鍪蠢2Q!!堡垒旦筮塑鲞筮!翅￡h巫』￡璺!丛型：血堡垫!Q：!吐塑：堕垒§ ·539· ．检验技术． 毛细管胶束电动色谱测定基因组DNA 甲基化水平 张慧敏 陶功华杨建平 庄志雄杨淋清柯跃斌 以0．45 qc保存备用。此5种脱氧核 DNA甲基化作为表遗传学的重要研究内容，是哺乳动 trm滤膜过滤后分装，4 物表达调控的主要表遗传学形式。研究表明，DNA甲基化 苷标准品的储备液浓度均为12．0mmol／L。(2)DNA抽提： 与肿瘤关系密切¨“，全基因组DNA低甲基化是肿瘤细胞基 按标准方法分别从人体全血和培养细胞中提取基因组 RNAase 本特征之一¨…，在肿瘤的发生和发展中存在DNA甲基化水 DNA，加20“g／tzlA于37℃孵育30rain消化RNA； 平和模式的混乱。DNA甲基化改变能否作为生物标志用于 再以等体积的预冷异丙醇沉淀基因组DNA，并用70％预冷 临床早期诊断已成为当前研究的热点。目前，用于DNA整 乙醇洗涤沉淀物，最后以Milli·Q级超纯水溶解基因组DNA 体甲基化水平检测方法有多种，但能真正从定馈的角度进行 快速、精确分析的方法却很少。笔者采用毛细管胶束电动色 样品4．0P．g溶于30¨l超纯水中，沸水浴2rain后立即置于 electrokinetic 谱(miceller mmol／L)和 capillarychromatography，MECC)法冰上冷却；向各样品中加入0．75p．I ZnS04(10 1．25 同时分离DNA酶解后5类单核苷酸(包括mdC)，建立了一 h；短暂离 txl核酸酶P，(200units／m1)，37℃下孵育16 种快速检测基因组DNA整体甲基化水平的方法。 心后，再加人1．25一Tris(0．5 mol／L，pH8．3)和0．75川碱 性磷酸酶(50units／m1)，于37℃下继续孵育3h；最后 材料与方法 10 min，酶解后样品直接上机检测或于4℃暂 000×g离心5 1．主要仪器：毛细管电泳仪(美国Waters公司)，正极进存。(4)毛细管电泳条件：70cm×75斗m的毛细管，有效分 样，汞灯，紫外检测波长为254am；内径75 mmol／LSDS及48mmoL／L txm未处理熔硅 离长度为65cnl，电解液为60 石英毛细管(河北永年公司)；用Millenium”2000软件进行 NaHCO，组成的缓冲溶液(pH9．6)，15kV恒压及20℃恒 数据处理；Aglienti100系列高效液相色谱仪(美国Waters公 温，汞灯，紫外检测波长254am，采用10cm高度重力进样 30 司)；超声波清洗器(德国Elma公司)；温育仪(美国Labnet s。(5)同收率实验：在dA、dT和dG(均为0．50mmol