细胞生物学研究方法科目讲解.pptVIP

第三章 细胞生物学研究方法;第三章 细胞生物学研究方法;第一节 细胞形态结构的观察方法;第二节 细胞组分的分析方法;第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术;一、光学显微镜技术（light microscopy;一、普通光学显微镜;;介质 ;（1）固定(fixation) 目的：使大分子交联而保持固定，避免实验中移位或丢失。 试剂：甲醛、戊二醛 机理：可与蛋白质的游离氨基形成共价键， 将邻近蛋白分子交联。 （2）脱水 （3）包埋（embed） 目的：包埋使组织变得坚硬,便于切片。 试剂：蜡、树脂 机理：可进入细胞内，起支持作用。 （4）切片（section） 目的：切成薄片，便于切片黏附在载玻片上进行染色。 仪器：切片机 切片厚度：1～10 ?m （5）染色（staining） 目的：使细胞成为可见。;方法： A.选择性染色 苏木精－细胞内核酸的分布 伊 红－细胞质染色 B.特异性染色 酶 + 底物 抗原 + 抗体;;二、荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy）;1. 原理;2、结构;3、应用;;;;三、相差显微镜;2、构造;; ; DIC显微镜下的硅藻;激光共焦扫描显微镜技术（Laser Confocal Microscopy）;;;二、 电子显微镜技术;电镜与光镜的比较;电子显微镜的基本构造;主要电镜制样技术;扫描电镜;一、 离心分离技术;二、 细胞内核酸、蛋白质、 酶、糖与脂类等的显示方法;例：DNA的Feulgen反应显示法 1924年， Feulgen 和Rossenbeck发明。 原理：盐酸水解，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，出现醛基，试剂中的无色品红与醛基反应，呈现紫红色。 例： PAS（高碘酸-席夫反应）──鉴定多糖类物质 高碘酸氧化多糖，游离出的醛基与Schiff试剂反应，生成红色化合物 。;;三、特异蛋白抗原的定位与定性;★步骤 荧光抗体制备 标本处理：组织切片、冷冻切片、整装细胞等 免疫染色：抗原-抗体反应 观察记录 ★免疫反应 直接法：Ag + Ab*?镜检（*代表标记物） 间接法：Ag + Ab1 + Ab2*?镜检 ★标记物可以为多种： 荧光素─免疫荧光技术或称荧光抗体法 酶─酶标抗体法（如辣根过氧化物酶） ;四、细胞内特异核酸的定位与定性;五、放射自显影技术;六．定量细胞化学分析技术;一、细胞的培养; 二、细胞工程 ;;;;用重金属盐(如磷钨酸) 染色；吸去染料干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。;;;聚焦透镜;;速度沉降：分离密度相近 而大小不一的细胞组分。;;;;;单克隆抗体技术是细胞杂交技术的成功应用.正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）具有分泌抗体的能力，但不能在体外长期培养，瘤细胞（如骨髓瘤）可以在体外长期培养，但不分泌抗体。于是英国人Kohler和Milstein 1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。;;;Hela 细胞（a) 和 CHO （b) 细胞的培养;细胞群体分散，对待测成分 进行特异荧光染色；细胞 高速通过细胞仪，当含单个 细胞的液滴通过激光束时， 带不同荧光的细胞所在液滴 被充上不同电荷，同时检测 器可测出并记录每个细胞中 的待测成分含量。不同标记 的细胞因所带电荷的差异， 当其通过高压偏转板时而发 生偏转，得以分离。;;;;;;;;思考题： 根据你目前所掌握的知识，在生命科学领域里提出一个你认为是很有意义的问题，并设计出解决该问题的方法。（5分）