肌球蛋白轻链激酶CaM结合位点突变体的构建、表达及功能研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他入已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：似 国 签字日期： 堕年』月竺日 学位论文版权使用授权书本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、使 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、使 用学位论文的规定，同意大连医科大学保留并向国家有关部门或机构 送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权 大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 文。 论文作者签名： 墨垦 旦 指导教师签名： 函题 签-7--日期：迎旦年』月竺目 肌球蛋白轻链激酶CaM结合位点突变体的构建、表达及功能研究 肌球蛋白轻链激酶CaM结合位点突变体的 构建、表达及功能研究 硕士研究生：张月 指导教师：高颖教授 专业名称：生物化学与分子生物学 摘 要 目的：肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kiansc，MLCK)是调节平滑肌收 缩的关键酶。通常情况下，在Ca2+和钙调蛋白(calmodulin，CaM)存在时，MLCK 磷酸化肌球蛋白20KD的调节轻链(MLC20)，进而增加肌球蛋白(myosin) M孑+．ATP酶活性，使肌球蛋白与肌动蛋白(actin)之间发生相互作用，引起肌肉 收缩，这是调节平滑肌收缩的经典途径。MLCK作为一种多功能的调节蛋白，除 具有磷酸化MLC20的激酶活性外，还具有与肌球蛋白和肌动蛋白结合的非激酶活 性。有研究表明，MLCK的非激酶活性在平滑肌的收缩中也起一定的作用。为了 更好的研究MLCK的非激酶活性，本实验利用牛胃重组全长野生型MLCK，对其 1002．1022氨基酸(即CaM结合位点)进行定点突变，使牛胃MLCK eDNA序列 中的T30№、G30、A3052、G3053、A3054、C3055、T3056突变为G30M、C30、G3052、 C3053、G3054、G3055、C3056，在氨基酸水平上Trpl006、Ar91018、Leul019将被突变为 Ala。并利用大肠杆菌表达系统成功地进行了大量表达，经纯化获得了重组的 MLCK突变体。检测了重组MLCK突变体对肌球蛋白的Mgz+．ATP酶活性的影响、 MLCK突变体与肌动蛋白的结合的活性以及对体外肌丝运动的影响，进一步证明 了MLCK的非激酶活性在平滑肌收缩过程中的调节作用。 方法：根据牛胃重组全长野生型MLCK的eDNA序列设计两条突变弓}物，通 过PCR反应进行定点突变。在大肠杆菌中表达重组全长野生型MLCK(WT／MLCK) 和CaM结合位点突变型MLCK(△CaM侏dLCK)，通过亲和层析及凝胶过滤进行 分离纯化。SDS检测表达及纯化的重组蛋白。Glycer01．PAOE检测重组MLCK 对MLC20的磷酸化水平。孔雀绿方法检测重组MLCK突变体对肌球蛋自的 M92+．ATP酶活性的影响。蛋白结合实验检测ca2+／CaM对重组MLCK与肌动蛋白 结合活性的影响。体外肌丝运动实验(加vitro motility assay)检测重组MLCK对 肌动蛋白肌丝运动速度的影响。 结果：测序结果显示成功构建了牛胃重组MLCK钙调蛋白结合位点突变体 (△CaM，MLCK)。ACaM／MLCK可以在大肠杆菌中以可溶形式大量表达，经CaM· Sepharose Sepharose 4B和Superose 6 HR纯化、SDS．PAGE鉴定得到较纯的单一条带。 Glycer01．PAGE显示重组全长野生型MLCK(WT／MLCK)具有磷酸化MLC20的 激酶活性，并随着MLCK浓度的增加MLC20的磷酸化水平也逐渐增加， ACaM／MLCK则失去了磷酸化MLC20的激酶活性。孔雀绿方法测得的酶活性结果 为：在无Ca2+／CaM存在时，随着ACaM／MLCK浓度的增加，非磷酸化肌球蛋白的 Mg+-ATP酶活性明显增加；而磷酸化肌球蛋白的M92+．ATP酶活性明显降低。结 合实验结果表明：WT／MLCK和ACaM／MLCK都具有与肌动蛋白结合的能力； Ca2+／CaM可以部分阻断WT／MLCK和肌动蛋白的结合(P0．05)，而Ca2+／CaM对 ACaM／MLCK和肌动蛋白结合的影响不大(P0．05)。体外运动实验结果显示：无 Ca2+