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α-淀粉酶的发酵、提取和活性测定 背景知识 淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称，广泛存在于动植物和微生物中。α-淀粉酶作用于淀粉时，可从分子内部切开α-1，4键而生成糊精和还原糖。产物的末端葡萄糖残基C1碳原子为α-构型，故称α-淀粉酶。如枯草杆菌BF7658 α-淀粉酶，广泛应用于食品、酿造、制药、纺织以至石油开采等许多方面。 一、实验目的 通过以α-淀粉酶的发酵生产为实例，学习和掌握酶的液体发酵和盐析沉淀法提取纯化的基本原理和过程，掌握α-淀粉酶分析方法、发酵和提取的评价标准。 二、实验原理 1、工业生产中酶的提取多数采用盐析沉淀法，即：通过加入不同的金属盐破坏酶的水化层同时中和酶的表面电荷，而使酶快速的形成沉淀，得到分离纯化。本实验通过向枯草杆菌发酵液中加入适量的硫酸铵，对发酵液中的胞外α-淀粉酶进行纯化提取。 2. 在碱性溶液(NaOH)中，双缩脲(H2NOC—NH—CONH2)能与Cu2+作用，形成紫色或紫红色的络合物，这个反应叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键（－CO－NH－），因此，蛋白质可与双缩脲试剂发生颜色反应。 此络合物在540nm吸收值在一定范围内与蛋白质的质量成正比. 3. 淀粉在碘液中会呈现紫色。α-淀粉酶作用于淀粉时，可从分子内部切开α-1，4键而生成糊精和还原糖。而糊精和还原糖在碘液中不显色，故可通过预先盛有淀粉和比色稀碘液的试管中的颜色变化（由紫色变棕色）来辨别反应终点。 三、实验步骤 1. 硫酸铵沉淀法从发酵液中分离α-淀粉酶。 先将固体硫酸铵研成细粉末，然后按37%（重量/体积比）的比例加入到经离心的发酵液中，混合均匀， 静置30min。 具体操作:5ml发酵液,加1.87克硫酸铵细粉末,混匀, 静置30min. 两组配平,4000r.m.p离心10分钟, 离心去除上清液保留沉淀。测活前加入10ml去离子水溶解。(即稀释一倍) 注意:(剩下的溶液留下来用于下一次测蛋白含量) 2.双缩脲法绘制小牛血清白蛋白标准曲线 取7支试管，编号，按下表加入试剂： 震荡15分钟，室温静置30分钟后，540nm比色，以蛋白质含量（mg/ml）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。 2. 取发酵液5ml +5ml去离子水(即稀释一倍) 3. 分别测定发酵液和提取液中的α-淀粉酶的酶活并计算它们各自的酶比活力 α-淀粉酶的酶活测定 （1）吸取1ml标准糊精溶液，置于盛有3ml标准稀碘液的试管中 （2） 在试管中加入2%可溶性淀粉20ml,加缓冲液5ml,在60度水浴中平衡4-5分钟,加入0.5ml稀释酶液,立即记时,充分混匀,1分钟后取出1ml反应液于预先盛有3ml比色稀碘液的试管内(也需放在水浴中),当颜色反应由紫色逐渐变成棕色,与标准比色管颜色相同时,记录时间为反应时间(发酵液和提取液每组各做2个重复) 计算: 酶活性单位:以1克酶粉或1ml酶液于60度,pH为6.0的条件下,在1小时内液化可溶性淀粉的克数表示 淀粉酶活力单位=(60/t *20*2%*f)/0.5=48*f/t 试中f表示酶的稀释倍数,t为反应时间 活性回收率=（提取液酶活×提取液体积）/（发酵滤过液酶活×用于盐析沉淀的发酵滤过液体积） 四、? 思考题 1．活性回收率通常小于1，有没有可能大于1，为什么？ 2.双缩脲法测定蛋白质质量，只与待测蛋白质质量有关，而与分子量无关，为什么？ 实验报告 清洁 * * 试 剂 管 号 1 2 3 4 5 6 7 标准蛋白溶液（ml） 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.5 ml (待测蛋白) +0.5 ml（0.1M NaOH） 0.05M NaOH（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 ? 双缩脲试剂（ml） 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 蛋白含量（mg/ml） 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 ?