黄孢原毛平革菌不同代谢阶段差异表达基因研究-遗传学专业论文.docx

I壅t／ll大学博士论文黄孢原毛平革菡代谢阶段差异表选基因研究黄孢原毛平革菌不同代谢阶段差异表达基因研究 I壅t／ll大学博士论文黄孢原毛平革菡代谢阶段差异表选基因研究 黄孢原毛平革菌不同代谢阶段差异表达基因研究 捅要 黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)属于白腐担子真菌，是 研究木质素生物降解的模式生物，该菌的基因组序列已由美国联合基因研究所 测定完成。P chrysosporium在进入次生代谢时产生2类依赖于心0。的过氧化 物酶一木质素过氧化物酶(LiP)和锰过氧化物酶(MnP)，它们是降解木质素的主 要酶类。早期的生理学研究表明，这2类酶的产生受营养因子、通氧量等因素 影响。分子生物学研究表明，这两类酶均由基因家族编码，培养基中的氮、碳、 热激、锰离子、分子氧等因素在转录水平上影响这些基因的表达，但其在次生 代谢期间的转录调控机理仍然不清楚。阐明P ohrysosporium参与进入次生代 谢过程中调控基因的表达规律不但有利于理解该菌的木质素降解机理，而且有 利于利用这种真菌。本文就P chrysosporium的次生代谢调控基因的克隆和表 达展开了较系统的研究，取得了相应的研究结果。 首先，用抑制消减杂交(Suppression Subtractive Hybridization，SS鳓和基因 芯片(Microarray)技术研究了黄孢原毛平革蓠在低氮培养基中培养48h和72h的 基因表达谱。构建了含1728个72h和868个48h特异eDNA克隆的抑制消减文 库：然后用巢式PCR法从中分别扩增出1555和767 EST片段；将它们点制成 基因芯片。用反转录自mRNA的RT探针和来自于cDNA文库的SSH探针分别 与芯片杂交。结果发现，SSH．探针与RT-探针的杂交结果有较大的差异，SSH- 探针能与98．8％的斑点杂交，而RT-探针仅能与57．9％的斑点杂交。RT探针杂交 结果的分析表明，在进入次生代谢的关键时间48h和72h期间，基因的表达有 明显的差异。在48和72h文库中共鉴定出224个差异表达的基因片段。荧光定 量RT-PCR分析表明，部分72h表达的基因具有十分明显的时间特异性。差异表 达片段的T检验表明，72h和48h显著差异表达的基因分别有12和23个。测定 的757个EST序列均可定位于只chrysosporium基因组的145个不同的Scaffold 上，其中部分EST序列可以被定位于2个以上的基因组位置上，暗示这些基因 可篚是基因家族。在72h特异序列中还发现了～些较为重要的基因：如芳香醇 脱氢酶基因、热激蛋白基因、硫氧还蛋n基因等。在48h特异表达的片段中有 vIll 四川大学博士论文黄孢原毛平革蓖代谢阶段差异表达基因研究泛素蛋白连接酶，脯氨酸亚氨基肽酶，细胞壁定位家族蛋白基因等。在72h的 四川大学博士论文黄孢原毛平革蓖代谢阶段差异表达基因研究 泛素蛋白连接酶，脯氨酸亚氨基肽酶，细胞壁定位家族蛋白基因等。在72h的 样品中还发现与H202代射帽关的基因，踣示它们可能由H，oz诱导，其产物可 能与减少次生代谢期间产生的H：02和其它过氧化物对细胞的伤害有关。 第二，在Linux系统下构建了一个用生物信息学方法处理EST序列数据的软 件平台。利用此平台完成了757个EST序列的载体序列的去除、EST Blast数据 库的构建、EST序列的分类组装、基因组定位和外显予和内含子的识别等过程。 并对SSH362、SSH2230进行了基因预测和蛋白模型构建。结果表明．这一系统 可以快速地对大批EST序列进行分析；757个序列可归类为217个基因，其中22 个72h特异表达的基因，54个48h特异表达的基因，65个比值接近于1的基因， 5l无杂交信号的基因。另有25个与粗毛栓菌(Trametesgallics)具有较高同源性 的基因。62基因按真核同源组进行分类(KOG)，结果发现6个与真核生物泛素系 统有关的基因。EST片段的拼接结果表明，7类序列可成功进行拼接；全部序列 在JGl white．rot vl网站上进行基因预测，结果表明，共有55个基因在内含子边 界上与实测的基因相近。其中SSH362 EST的预测得到一条636bp的CDS，和 1236bp的全基因，并根据预测序列设计引物进行PCR扩增，获得了全长CDS序 列。用SwISS．MODEL构建了SSH2330的预测蛋白的三维模型，该模型含5段 B折叠，3段a螺旋，与酵母菌的20S蛋白酶体亚基同源。 第三，利用RT—PCR方法分析了在10种不同的限定培养基生长5d和天然冷 杉木片上培养2-8周的黄孢原毛平革菌木质纤维索生物降解相关基因的表达。 结果显示，木质素过氧化物酶基因家族的不同成员对不同的