广寄主的反转录病毒载体.PPTVIP

张 文 倩  zhang wen qian 生命科技学院 生物科学类1302 1610130225 反转录病毒载体 反转录病毒载体 反转录病毒(retroviruses)是一类含单链RNA的动物病毒。它的基因组含有2条相同的正链RNA分子，包装成二倍体病毒颗粒。除此之外，在其病毒颗粒内部还包含有tRNA引物分子、反转录酶、RNaseH和整合酶等组分。迄今已经在鸟类及哺乳类动物中发现了许多种反转录病毒，例如鸟类的脾坏死病毒(SNV)、鼠类的乳腺肿瘤病毒(MMTV)，莫洛尼氏小鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，MoMLV)等等，但其中研究得最为详尽的则要数劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)。RSV病毒感染了鸡之后，就会诱发产生肿瘤。从感染细胞中分离出来的反转录病毒的DNA，是一种有用的动物细胞的基因载体。 反转录病毒家族的三种不同的类群 ①泡沫病毒(foamy viruses)类群， 例如人泡沫病毒(HFV)； ②慢病毒(lentiviruses)类群，例如人免疫缺损病毒(HIV)I型和II型，以及绵羊髓鞘脱落病毒(Visna virus)等； ③致癌病毒(onco viruses)类群。并非所有本类群的病毒都是致癌的。根据在电子显微镜下观察的病毒颗粒的形态学特征的差异，致癌病毒类群又可区分成A、B、C、D四个类型。 反转录病毒的优点 第一，在大多数情况下，反转录病毒的肿瘤基因(oncogene，onc)都能够在正常的细胞中转录。 第二，反转录病毒的寄主范围相当广泛，包括无脊椎动物和脊椎动物。 第三，反转录病毒具有强启动子，克隆此类载体上的外源基因有可能得到有效的表达。 第四，反转录病毒不但感染效率高，而且通常还不会招致寄主细胞的死亡，被它感染的或转化的动物细胞能够持续许多世代，保持正常生长和形成感染性病毒颗粒的能力。 反转录病毒的生命周期 一种典型的反转录病毒的生命周期，是从它的感染颗粒同寄主细胞表面待定的接受器结合，并进入细胞的时候开始的。整个周期可以分为两个不同的时相 反转录病毒基因组的特点 在反转录病毒(例如RSV)颗粒内部，总共有4条RNA分子链。其中2条较大的完全相同的单链RNA，即是反转录病毒基因组，编码病毒的全部遗传信息。这2条RNA分子又叫做38S RNA链，两者之间通过4个氢键相互结合在一起。另外2条较小的是寄主细胞的tRNATrp，而在小鼠反转录病毒颗粒中发现的只有tRNAPro。这种tRNA分子的3’-末端部分，通过氢链与38S RNA链(距5’-末端101个核苷酸处)结合。 RSV病毒RNA基因组的另一个重要特点是，每一条38S RNA链，都带有2段相同的(或极其相似的)特称为r序列的非编码区段(图8-20)。其中一段与5’-末端的帽结构相邻，另一段紧接于3’-末端的poly(A)200序列。除此之外，还具有2种非编码的u3和u5序列。u5序列长约100个核苷酸，位于5’-末端r序列之后，而u3序列则较长，可达1000个核苷酸左右，它靠近3’-末端的r序列。 反转录病毒的复制 反转录病毒在进入寄主细胞质之后不久，就开始进行其基因组的复制活动，在这个反转录过程中，只有一条38S的RNA链转变成为双链的DNA分子。首先由一分子包裹在病毒颗粒中的寄主细胞的tRNA，同病毒RNA序列上的负链引物结合位点(negative strand primer binding site, PBS-ve)杂交。反转录酶便开始以此 tRNA为引物，(＋)RNA作模板，催化(－)DNA链的合成，并沿着从引物的3’-OH末端到模板的5’-末端方向延伸。此种转录形成一段很短的 R-U5的(－)DNA拷贝，又叫做强终止 DNA(strong stop DNA)。随后，反转录酶便改向从病毒RNA模板的 3’-末端继续合成(－)DNA链。与病毒RNA模板被RNaseH降解掉的同时，在正链引物结合位点(pBS+ve)也开始第二链DNA合成。形成的双链DNA环化之后，便整合到寄主细胞染色体基因组上，成为原病毒。 反转录病毒载体的主要类型 辅助病毒互补的反转录病毒质粒载体 不需要辅助病毒互补的反转录病毒质粒载体 广寄主的反转录病毒载体 反转录病毒表达载体 辅助病毒互补的反转录病毒质粒载体 辅助病毒互补的反转录病毒粒载体，是 20世纪 80年代初发展起来的一种简单的正转录病毒基因转移系统。其关键的步骤是利用DNA体外重组技术，将克隆在大肠杆菌pBR322质粒载体的原病毒DNA，移去gag、 pol和env等3个基因的大部或全