鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白亲和肽特性及相关受体功能研究-兽医学;基础兽医学专业论文.docxVIP

Classified Classified Index： Code：10224 Confidential(yes／no)．nO NO．90061 Dissertation for the Doctoral Degree Screening and Characterization of Infectious Bronchitis Virus S 1 High—-affinity Peptide and Its Related Receptor Function Candidate：Panlong Supervisor：Prof．Liguangxing Degree Category：Doctor ofAgriculture College：College of Veterinary Medicine First level discipline：Veterinary Science Second level discip：Basic Veterinary Science Harbin China December 20 14 万方数据 IIIIll IIIIll 111111IllllUlllll I[1lll II 111 Y2771 827 目录 目 录 中文摘要 l 英文摘要 一III l引 言 ， ．1 1．1冠状病毒基因组结构和相关蛋白研究进展 ．．1 1．1．1冠状病毒的分类 ．1 1．1．2冠状病毒基因组结构特点 ．．2 1．1．3冠状病毒基因组功能 5 1．1．4冠状病毒相关受体结构和功能 1l 1．2鸡传染性支气管炎研究进展 一13 1．2．1鸡传染性支气管炎的流行病学 ．13 1．2．2鸡传染性支气管炎的临床症状和病理机制 ．14 1．2．3鸡传染性支气管炎的诊治 16 1．3噬菌体展示技术的研究进展 ～16 1．3．1噬菌体展示技术概述 16 1．3．2模拟病毒蛋白表位 16 1．3．3病毒作用机制的研究 ．17 1．3．4在新型疫苗研制方面的应用 17 1．4研究的目的和意义 ．18 2材料与方法 ．1 9 2．1实验材料 ．．19 2．1。1实验动物 19 2．1．2菌种、载体及质粒 一 1 9 2．1．3工具酶、试剂盒和抗体试剂 19 2．1．4标准参照物 19 2．1．5实验试剂的配制 20 2．1．6仪器设备 2l 2．2实验方法 22 2．2．1 IBV S1基因的克隆及原核表达质粒的构建 ．22 2．2．2 IBV Sl基因的原核表达及鉴定 26 2．2．3噬菌体随机十二肽库对sl重组蛋白亲和配体的生物淘选 27 2．2．4噬菌体结合克隆的特征鉴定、序列测定及多肽合成 一30 2．2．5 sl蛋白亲和多肽的体外抗病毒活性检测 ．32 2．2．6荧光标记sl蛋白亲和多肽对IBV感染雏鸡组织内病毒的检测 33 2．2．7 IBV检测方法的建立 ．34 2．2．8 gAPN基因的克隆及原核表达 36 2．2．9 gAPN重组蛋白的纯化、多抗制各及活性鉴定 37 万方数据 东北农业大学农学博士学位论文2．2．10 东北农业大学农学博士学位论文 2．2．10 gAPN真核表达质粒的构建及转染 ．38 2．2．1l S1蛋白与gAPN蛋白的亲和鉴定 ．39 2．2．12 gAPN多克隆抗体对IBV感染CEK细胞的阻断 40 2．2．13 gAPN介导IBV感染Hela细胞 41 2．2．14 gAPS的生物信息学分析 42 3结果 一43 3．1 IBV S1基因的克隆及原核表达质粒的构建 43 3．1．1 IBV SI基因的RT-PCR扩增 ．43 3．1．2 S1基因重组原核表达质粒的构建及鉴定 ．43 3．2．Sl重组蛋白的表达及鉴定 ．45 3．2．1 S1重组蛋白的表达 45 3．2．2 S1重组蛋白的Western blot鉴定 一45 3．3噬菌体十二肽库对sl重组蛋白亲和配体的生物淘选 一46 3．3．1 S1重组蛋白的纯化 46 3．3．2噬菌体十二肽库对靶分子的四轮淘洗 ．47 3．3．3 s1蛋白亲和多肽的抗病毒活性检测 49 3．3．4荧光标记sl蛋白亲和多肽对IBV感染雏鸡组织内病毒的检测 50 3．3．5 mv检测方法的建立 ．62 3．4 gAPN的原核表达、多抗制备及生物学功能的研究 一65 3．4．1 gAPN基因的克隆 65 3．4．2 gAPN基因的原核表达 ．．67 3．4．3 gAPN多克隆血清制备及生物学功能的测定 68 3．5 gAPN真核表达质粒的构建和瞬时转染 ．69 3．5．1 gAPN真核表达质粒的构建 ．．69 3．5．2 gAPN真核表达质粒的的转染 ．．70 3．6 S1蛋