鸡BF2和β2m分子特征与二级结构及其复合体鉴定病毒表位的分析-预防兽医学专业论文.docx

中国农业大学博士论文 中国农业大学博士论文 摘要 摘要 鸡的主要组织相容性复合体l(B一位于16号染色体，分为主基因座(BF2)和次基因座(BFl)。 肌2呈显性表达．可与抗原多肽和轻链(f12m)结合，将抗原多肽递呈给CTL细胞，诱导机体产生细 胞性免疫应答。为了阐明我国地方优质品种鸡BF2和P2m的分子结构特征。解折BF2及B 2m蛋白 的空间结构、以及重建BF2．B 2m复合体结合病毒抗原多肽系统，本研究采用PCR技术从三黄鸡、 鸟骨鸡和珍珠鸡群克隆了24个BF2基因和lO个,82m基因。用pMAL—p2X／E．coli可溶性表达系分别 表达了BF2和B 2m与MBP融合蛋白。通过Amylose树脂亲合层析纯化、FactorXa蛋白酶切、DEAE 琼脂塘分子筛过拄，纯化了表达蛋白：MBP-BF2、MBP．132m、MBP。采用圆二色谱(cD)测 定了各类蛋白的二级结构(2D)；并同源模建了BF2$n B 2m蛋白的三级结构(3D)。 随后，设计了一个富含甘氨酸和丝氨酸的接头[1inker，(GdS)3】，采用SOE-PCR技术将 BF2．1inker-f12m串联成基因链，3黼．N．pMAL．p2x质粒进行可溶性融合表达并按上述方法分离纯 化了融合MBP．BF2-1inker-13 2m和单体BF2一linker-B2m蛋白。圆二色谱(cD)测定了其2D，在此 研究的基础上，采用了禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)T细胞表位多肽(AIV-HA5-TPl和 AIV-HA9．TP2)-与BF2一linker-B 2m蛋白结合，用酸洗法从BF2一linker-B 2m—peptide复合物中洗出 AIV-HA5一TPl和AIV-HA9一TP2，再用C18柱去盐、去酸、换缓冲液，并冻干AIV-HA5-TPI和 AIV-HA9一TP2，点样后用质谱仪测定其分子量和氨基酸序列图谱。 三品种鸡BF2氨基酸之问同源率为75．5％--99．2％，分别保留了^H￡d卅2与抗原多肽结合的8 个关键性氨基酸(YYYRTKWY)@的7、7、6个氨基酸。在抗原多肽结合区(PBD)氨基酸置换率 高，与cD8+、廖m接触的氨基酸大多保守。根据本研究自创氮基酸嗣源率91％为一类系谱的 分类方法，将三品种鸡的24个BF2基因与所有来航鸡BF2基因分为11个系谱。其中，发现了三品 种鸡中有5个等位基因群不同于来航鸡，为新的等位基因群。同时也发现了一类新的鸡应Ⅲ，与已 报道的鸡,02m氨基酸的同源率为81．9％一84．O％。结果显示了三品种鸡BF2和口2m的分子特征。 CD结果表明t BF2蛋白呈典型的a螺旋结构，其2D结构元件n螺旋、B折叠、转角和随机蜷 曲)的含量分别为72、)02、70和90个氨基酸；B 2m蛋白中分别为0、46、30和22个氨基酸；单体 重组蛋FIBn-linker-B 2m中分别为70、149、108和124个氨基酸。CD钡IJ定I=IgBF2蛋白中a螺旋含 量与ExPAsY服务器【iⅡ姬；也s：￡lD签丛Q型!Q囱s凸上预测的结果基本相符。鸡BF2、B 2m蛋白以及重 组BF2-linker-B 2m蛋8级结构元件含量与人HLA—A2；}11 B 2m的相似。同源模建的BF2TU B 2m 3D 与人及小鼠的类似，但在a螺旋、0片层、B转角、无规则蜷曲的具体位置与数目方面存在差异。 质谱图谱表明，重建的BF2．1inker．B 2m在体外可成功结台AIV．HA5．TPI和AIV．HA9-TP2。 这为进一步重建鸡MHC*B 2m复合物体外鉴定病毒T细胞表位系统奠定了基础。 综上所述，本研究揭示了三品种鸡BF2和芦2域基因的分子特征，获得了具有正常结构的BF2、 B 2m以及BF2-linker-13 2m重组蛋白，阐明了其2D，并在体外初步重建TBF2．13 2m复台体结合病 毒抗原多肽系统。 关键词： 鸡，主要组织相容性复合体I，分子特征，二级结构，同源模建，T细胞表位 AbstractChicken Abstract Chicken Major hislocompatibility complex(MHC)class I molecules(聊locates 16 chromosome and has two loci·encoding class l heavy chains：BF／and BF2．The BFl is min